ПОЛУЧЕНИЕ И СВОЙСТВА МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К НЕСТРУКТУРНЫМ БЕЛКАМ ВИРУСА КЛЕЩЕВОГО ЭНЦЕФАЛИТА

Аннотация:

Получены гибридомы, секретирующие МКА к вирусу клещевого энцефалита (ВКЭ). 3 МКА к белку NS3 ВКЭ
относятся к классу IgМ, остальные -к lgGI, что показано методом иммунодиффузии.
МКА к белку NS1 ВКЭ тестированы в реакции торможения гемагглютинации, связывания комплемента,
нейтрализации и протекции. Показано, что только 1 гибридома продуцировала МКА, специфичные для
белка NS1 штамма Софьин ВКЭ, а все остальные взаимодействовали с общими антигенными детерминантами неструктурного гликопротеина комплекса ВКЭ.
Вирус клещевого энцефалита (ВКЭ) семейства
Flaviviridae является патогеном, вызывающим поражение центральной нервной системы. Роль неструктурных белков флавивирусов в развитии патологического процесса остается практически неизученной. Моноклональные антитела (МКА) к
вирусным белкам могут применяться для изучения
структурно-функциональных свойств белков ВКЭ
и усовершенствования методов диагностики клещевого энцефалита (КЭ). В литературе имеются
описания МК.А к неструктурным белкам NSI,
NS3, NS5 некоторых флавивирусов [2, 7], однако
для большинства неструктурных белков ВКЭ такие
МКАдо настоящего времени не получены.
Цель работы состояла в получении МКА к неструктурным белкам дальневосточного подтипа
ВКЭ (штамм Софьин) и изучении их свойств.
Материалы и методы
Получение МКА. Для получения протективного
иммунитета 8-недельных самок мышей линии
BALB/c иммунизировали 10 мкг очищенного белка
Е оболочки ВКЭ [5] внутрибрюшинно с полным
адъювантом Фрейнда. Повторные иммунизации
проводили также внутрибрюшинно 20% мозговой
суспензией инфицированных мышей-сосунков в
различное время от начала иммунизации. Для 1-й
гибридизации с миеломой Sp2/0-Ag-14 животных
иммунизировали через 28 и 38 дней. При 2-й гибридизации с клетками миеломы NS-l/Ag4-l антиген
вводили через 28, 42 и 52 дня. Бустерную дозу антигена вводили внутривенно. Гибридизацию проводили на 4-й день после последней иммунизации
по стандартной процедуре [10]. Для слияния клеток применяли полиэтиленгликоль с мол. массой
4000 ("Sigma", США). МКА в культуральных жидкостях гибридных клеток выявляли методом иммуноблоттинга. В качестве антигенов использовали
лизаты перевиваемых эмбриональных клеток почек свиньи (СПЭВ) через 48 ч после заражения
ВКЭ с множественностью инфекции 30 БОЕ/клетка. Лизаты незараженных клеток СПЭВ применяли в качестве отрицательного контроля. МКА к
белку NSI при 2-й гибридизации выявляли точечным иммуноферментным анализом (ТИФА). Положительно отвечающие гибридомы дважды клонировали методом предельных разведений из расчета 0,3-1,3 клетки на лунку 96-луночного планшета. Асцитические жидкости получали внутрибрюшинной инъекцией 102-102 гибридомных
клеток на мышь линии BALB/c. Животным предварительно вводили 0,5 мл пристана (2, 6, 10, 14тетраметилпентадекан; "Sigma, США) или вазелинового масла.
Градиентный гель-электрофорез белков и иммуноблоттинг. Лизаты зараженных ВКЭ клеток разделяли в градиентном 7-25% полиакриламидном
геле в денатурирующих условиях по методу U. Laemnili [9]. Белки переносили на нитроцеллюлозную
мембрану (0,45 мкм, "Schleicher & Schuel", Германия) по методу Н. Towbin [17]. Инкубацию с МКА
проводили в течение ночи при комнатной температуре. Комплексы антиген-антитело выявляли
антителами козы к иммуноглобулинам мыши, меченными пероксидазой хрена, с последующим окрашиванием раствором субстрата (0,18 мг/мл 4-С11-нафтол, "Sigma", США, 0,01% Н202, 0,02М трисНСI, 0,15М NaCI, рН 7,5).
ТИФА. Для проведения ТИФА использовали
белок NSI, очищенный в соответствии с методом
[12]. На нитроцеллюлозные фильтры (0,45 мкм;
"Schleicher & Schuel", Германия) сорбировали по
40 нг белка NSI в объеме 0,2 мкл на квадрат размером 4 х 4 мм. Дальнейший анализ МКА в культуральных и асцитических жидкостях проводили
по методу [4].
Иммуноферментный анализ (ИФА). Взаимодействие МКА с вирусами комплекса КЭ анализировали с помощью 4-слойного ИФА [3]. Иммуноглобулины класса G сыворотки кролика, иммунизированного белком NSI (штамм Софьин), в концентрации 5 мкг/мл сорбировали в лунках 96-луночного планшета в течение 3 ч при 37°С. После
отмывок добавляли одинаковое количество предварительно оттитрованного соответствующего растворимого антигена вируса группы КЭ (64-128 антигенных единиц), осажденного из культуральной
жидкости полиэтиленгликолем (мол. масса 6000), и
инкубировали 18 ч при 4°С. Затем добавляли асцитическую жидкость клона, секретирующего МКА к
белку NSI ВКЭ, или мышиную гипериммунную асцитическую жидкость (ИАЖ) против белков ВКЭ в
различных разведениях и инкубировали 1 ч при
37°С. После инкубации с антителами к иммуноглобулинам мыши, конъюгированным с пероксидазой
хрена, связавшийся конъюгат определяли по расщеплению Н2О2 в присутствии хромогена ортофенилендиамина при 492 нм.
Иммунодчффузионныи тест. Идентификацию
классов и подклассов МКА проводили методом иммунодиффузии по Оухтерлони с использованием
антисывороток, специфичных к мышиным lgM,
lgG, lgA и подклассам lgG ("Sigma", США) [8].
Реакцию нейтрализации ВКЭ проводили по методу уменьшения числа бляшек вируса на культуре
клеток СПЭВ [5], реакцию биологической нейтрализации -по методу [1], реакцию торможения гемагглютинации -по методу [6], реакцию связывания комплемента -по методу [8].

Авторы:

Издание: Вопросы вирусологии
Год издания: 1998
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 1998.-N 3.-С.134-137
Просмотров: 145