УТОЧНЕНИЕ ЛОКАЛИЗАЦИИ РЕЦЕПТОРСВЯЗЫ-ВАЮЩИХ САЙТОВ МОЛЕКУЛЫ ЧЕЛОВЕЧЕСКО-ГО Y-ИНТЕРФЕРОНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДОВ, СООТВЕТСТВУЮЩИХ ЕГО ФРАГМЕНТАМ

Аннотация:

Институт экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург,
Католический университет, Левен, Бельгия, Институт иммунологии, Любучаны, Московская обл.
Человеческий у-интерферон (у-ИФН) представляет собой полипептид, содержащий 143 аминокислоты; структура его молекулы детально изучена. Биологические эффекты у-ИФН опосредованы его связыванием со специфическим рецептором, структура которого также подробно описана [2]. Однако до сих пор остается неясным, какие участки молекулы у-ИФН вовлечены во взаимодействие с рецептором. При изучении этого вопроса используются разные методологические
подходы: исследование биологической активности
мутантных молекул у-ИФН, выявление в молекуле -у-ИФН эпитопов, связывающих нейтрализующие моноклональные антитела (МКАТ), изучение
способности различных пептидов из состава
у-ИФН конкурировать с у-ИФН за связывание со
специфическим рецептором и с МКАТ. В частности, для N-концевого остатка у-ИФН 1-39 и его
фрагмента 4-16 ранее была показана способность
блокировать связывание у-ИФН со специфическим рецептором и отдельные проявления его
биологической активности [8]. В других исследованиях, посвященных изучению пептидов из состава человеческого у-ИФН, в качестве возможных участков связывания с рецептором рассматривались не только N-концевые (7-16), но и
С-концевые (121-130) пептиды [9].
Целью настоящего исследования было уточнение локализации рецепторсвязывающих сайтов
молекулы человеческого у-ИФН. В задачу исследования входило проведение экспериментов для
изучения возможной конкуренции отдельных
синтетических пептидов из состава у-ИФН с рекомбинантным человеческим у-ИФН за связывание с рекомбинантным растворимым рецептором
у-ИФН; с антиидиопическими антителами к
у-ИФН за связывание с рекомбинантным у-ИФН.
Методика исследований. Человеческий у-ИФН получен как
рекомбинантный продукт путем экспрессии в клетках Е. coli и
очищен, как описано ранее [5]. Этот препарат был подвергнут
йодированию по методу [12]. Активность -у-ИНФ составляла
2-10^ МЕ/мг, специфическая радиоактивность '^1-у-ИФН 18 мкКи на 1 мк.г. Растворимый рецептор у-ИФН, содержащий
экстрацеллюлярную часть рецептора, был получен как рекомбинантный продукт путем экспрессии в клетках мышиной
миеломы J558L по описанному ранее методу [1]. МКАТ к
у-ИФН получали по методу [10], накапливали в асцитической
жидкости и выделяли с помощью преципитации сернокислым
аммонием. Антиидиотипические антитела к у-ИФН были получены. как описано ранее [4]. Пептиды синтезированы твердофазным методом с помощью автоматизированного пептидного синтезатора с последующей очисткой методами гельфильтрации и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Аминокислотный состав каждого пептида проверяли с
помощью автоматического аминокислотного анализатора.
Иммуноферментный анализ (ИФА). у-ИФН в концентрации
2 мкг/мл или растворимый рецептор у-ИФН в концентрации
2 мкг/мл инкубировали в 96-луночных планшетах ("Nunc") в
течение 18-20 ч при 4°С, после чего проводили насыщение
лунок планшетов 1% раствором казеина в фосфатном буферном растворе (ФБР) для блокирования неспецифического связывания белка в лунках в течение 1 ч при 37°С. После этого
у-ИФН, антиидиотипические антитела или МКАТ к у-ИФН в
постоянной концентрации 1 мкг/мл в чистом виде (контроль)
либо смешанные с различными концентрациями пептидов (от
100 до 6,25 мкг/мл) добавляли в соответствующие триплеты
лунок и инкубировали 1 ч при 37'С. Между каждым сроком
инкубации планшеты отмывали по 3 раза ФБР с 0,05% твина20. После последующей инкубации с поликлональной кроличьей иммунной сывороткой против у-ИФН (1 мкг/мл) реакцию проявляли инкубацией с антикроличьими антииммуноглобулиновыми антителами, конъюгированными с пероксидазой хрена (НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург), с перекисью водорода в качестве субстрата и ортофенилендиамином. Для проявления связывания МКАТ использовали антитела к иммуноглобулинам мыши, меченным пероксидазой хрена
(НИИ вакцин и сывороток, Санкт-Петербург). После развития
окраски оптическую плотность учитывали с помощью автоматического спектрофотометра "SLT-Spectra" (Австрия) при длине волны 492 нм. Данные по триплетам усредняли. Эксперименты с каждым из сочетаний лигандов проводили 3-кратно.

Авторы:

Издание: Иммунология
Год издания: 1998
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 1998.-N 3.-С.24-27
Просмотров: 30