НАУЧНЫЕ ДОСТИЖЕНИЯ В ОБЛАСТИ ПРОИЗВОДСТВА АНАТОКСИНОВ

Аннотация:

Проблема создания эффективных препаратов для профилактики газовой гангрены насчитывает десятки лет, но и в настоящее время считается актуальной [21, 22]. Проведены многочисленные исследования [3, 16, 23, 24] в целях создания профилактических анатоксинных препаратов против анаэробных инфекций и повышения качества. Однако исследования, посвященные разработке методов получения очищенных сорбированных гангренозных анатоксинов, не вышли за пределы лабораторных экспериментов. В связи с этим потребовалась разработка методов культивирования патогенных клостридий и получения токсинов-анатоксинов в реакторах большой емкости. В конце 1966 г. МЗ СССР было поручено приступить к разработке ассоциированного препарата - секстаанатоксина, предназначенного для профилактики столбняка, ботулизма и газовой гангрены. Разработка технологического процесса реакторного получения ботулинических анатоксинов типов А, В, Е проводилась на базе Уфимского НИИВС, гангренозных анатоксинов - в Московском и Пермском НИИВС. Для успешной реализации этой задачи проведены исследования в следующих направлениях: 1. совершенствование питательных сред для глубинного выращивания Clostridium perfringens типа А и C.oedematiens типа А; 2. определение оптимальных параметров процесса роста и токсинообразования C.perfringens типа А и С.оеdematiens типа А (рН, гН, Dim, L,, потребление углеводов и азотистых веществ, компонентного состава токсинов), обеспечивающих при глубинном выращивании клостридий получение высокоактивных токсинов; 3. отработка оптимальных условий детоксикации анатоксинов перфрингенс и эдематиенс при максимальном сохранении их антигенной активности; 4. исследование различных методов очистки и концентрации гангренозных анатоксинов. Предлагаемая технология реакторного метода приготовления казеиновых гидролизатоа с повышенным содержанием белковых и пептидных фракций разработана на основе найденных оптимальных условий гидролизата казеина (количество казеина, фермента, соляной кислоты, продолжительность процесса, величина рН и температуры). На усовершенствованных питательных средах получены высокоактивные гангренозные токсины. Средние титры токсинов C.perfringens на панкреатической и протеазной, а токсинов C.oedematiens - на пепсинной и кислотной казеиновых средах соответственно составляли 1040,6 и 720 Dlm/мл; 20800 и 10700 Dtm/мл [15, 18]. В результате изучения основных факторов, определяющих процесс токсинообразования при реакторном культивировании C.perfringens типа А штамма ВР6К-28 и C.oedematiens типа А штамма 79 (рН, гН, потребление углеводов и азотистых веществ), установлено, что лимитирование изменений каждого из них и подбор питательных сред с учетом параметров физикохимических сдвигов в среде обеспечивает получение высокоактивных гангренозных токсинов. Впервые установлены компоненты токсина перфрингенс в следующих количествах: лецитиназа - 660 - 2000 Lv/мл; тэта-гемолизин - 2290-12650 ГЕ/мл; коллагеназа - 69,96 - 77,47; гиалуронидаза - 2,0- 10,0; протеиназа - 0,028 - 0,729 ед/мл. Детоксикация нативного токсина перфрингенс оптимальна при дробном добавлении формалина, при котором происходит более интенсивное образование метиленовых связей формальдегида с токсином перфрингенс и снижение токсичности. Формалин добавляется в дозе 0,015% с различными временными интервалами. Общая доза колебалась в пределах 0,6 - 0,7% в зависимости от высоты титра токсина перфрингенс. Данный метод позволяет избежать чрезмерного денатурационного воздействия на токсин и повысить активность нативного анатоксина перфрингенс (а.п.) до 8-14 ЕС/мл против 5 - 7 ЕС/мл по общепринятой схеме [5]. Оптимальным вариантом оказался метод двухэтапной очистки (осаждение соляной кислоты при рН 3,3+0,1 в присутствии гексаметафосфата натрия и фильтрации через гель сефадекса Г-75), обеспечивающий получение а.п. с удельной активностью 300 - 500 ЕС на 1 мг белкового азота. Полученные очищенные гангренозные анатоксины в дозе 100 ЕС полностью сорбировались на геле гидрооксида алюминия (0,4-0,5 мг А^Од). Разработка промышленной технологии получения гангренозных анатоксинов в Московском и Пермском НИИВС завершилась составлением совместного регламента производства. Созданный в период 1966 - 1969 гг. совместно с коллективами Московского и Уфимского НИИВС новый ассоциированный препарат - секстаанатоксин был утвержден Комитетом вакцин и сывороток МЗ СССР и принят к массовому производству. Применение секстаанатоксина для активной иммунизации населения против анаэробных инфекций показало, что наиболее слабым антигеном в составе ассоциированного препарата является а.п. Об этом свидетельствует уровень антитоксина в сыворотке крови после иммунизации людей секстаанатоксином: столбнячный - 3,07; ботулинические типов А, В, Е соответственно - 0,56, 0,6, 0,7; перфрингенс - 0,18: эдематиенс - 0,78 МЕ/мл (средняя геометрическая титров). Одним из путей повышения иммунологической эффективности а.п. является получение препарата из очищенного токсина [10]. В результате проведенных исследований по сравнительной оценке различных методов очистки токсина перфрингенс впервые была предложена следующая технология: осаждение нативного токсина перфрингенс солями хлорида натрия и хлорида цинка, элюция полученного осадка р-ром двузамещенного фосфата натрия, концентрирование элюата ультрафильтрацией, очистка концентрата на углеродном сорбенте марки СКН и обезвреживание очищенного токсина формалином в присутствии L-лизина. Получены препараты с удельной активностью 400 - 450 ЕС на 1 мг белкового азота [8].

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 1998
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 1998.-N 2.-С.28-32
Просмотров: 924