КИНЕТИЧЕСКАЯ И МОЛЕКУЛЯРНАЯ МОДЕЛЬ АКТИВИРОВАННОГО РАСЩЕПЛЕНИЯ ДНК ЭНДОНУКЛЕАЗОЙ РЕСТРИКЦИИ EcoRII

Аннотация:

Эндонуклеаза рестрикции EcoRIl (ЭР EcoRll) типичный представитель ферментов рестрикции, которым для осуществления гидролиза необходимо одновременное взаимодействие с двумя участками узнавания в ДНК. Проведен кинетический анализ гидролиза синтетических субстратов этим ферментом и определено число фосфодиэфирных связей, расщепляемых в составе одного ферментсубстратного комплекса. 71-звенный ДНК-дуплекс с одним участком узнавания EcoRll очень плохо расщепляется этим ферментом, но его гидролиз может быть активирован добавлением 14-звенного субстрата (активатора). Кинетический анализ позволил выявить конкурентный механизм этой активации. Активация влияет на связывание 71-звенного субстрата с ЭР EcoRII, а не на катализ: величина Км является функцией концентрации активатора (Км уменьшается от 740 до 140 нМ при увеличении концентрации активатора от 0 до 500 нМ), тогда как Ущш (около 5 нМ/мин) не зависит от концентрации активатора. Согласно классической модели конкурентной активации, такие результаты соответствуют ситуации, когда две молекулы субстрата обратимо и взаимозависимо связываются с одним и тем же центром связывания в ферменте. В соответствии с этой моделью активация значительно уменьшается при увеличении концентрации активатора выше 500 нм. Эти результаты подтверждают предложенную нами ранее кинетическую схему расщепления ДНК эндонуклеазой EcoRII [1]. С помощью 71-звенных субстратов, где два участка узнавания сведены в состав одной молекулы, показано, что фермент гидролизует в одном фермент-субстратном комплексе только две фосфодиэфирные связи (а не четыре). Чтобы решить вопрос о том, принадлежат ли обе связи одному участку узнавания или разным, в одном из участков узнавания 71-звенных дуплексов гидролизуемые фосфодиэфирные связи заменяли на негидролизуемые пирофосфатные - поочередно или одновременно в обеих цепях. Это позволяло выключать соответствующие связи из гидролиза. Обнаружено, что эндонуклеаза -EcoRII одновременно расщепляет две межнуклеотидные фосфодиэфирные связи, принадлежащие одному участку узнавания.

Авторы:

Издание: Молекулярная биология
Год издания: 1998
Объем: 2с.
Дополнительная информация: 1998.-N 2.-С.361-362
Просмотров: 27