ФЕНИЛАЛАНИЛ-тРНК-СИНТЕТАЗА Thermus thermophilus: ЛОКАЛИЗАЦИЯ ЦЕНТРА СВЯЗЫВАНИЯ тРНК НА СУБЪЕДИНИЦАХ С ПОМОЩЬЮ ФОТОАФФИННЫХ АНАЛОГОВ

Аннотация:

Исследована аффинная модификация фенилаланил-тРНК-синтетазы, имеющей необычную олигомерную структуру к^-типа, аналогами тРНК^, содержащими остатки 4-тиоуридина (s^U). Благодаря удачным структурным и фотохимическим характеристикам s^U подобные аналоги нуклеиновых кислот успешно используются для изучения нуклеиново-нуклеиновых и белково-нуклеиновых взаимодействий. До сих пор тиолированные аналоги тРНК не находили широкого применения для структурно-функциональных исследований аминоацил-тРНК-синтетаз, хотя могут быть использованы для локализации прямых контактов тРНК в специфичном комплексе с синтетазой. Для включения остатков sU в различные участки структуры тРНК использовали систему транскрипции. Аналог тРНК, терминированный с З-конца остатком s^U ([s^U - 75]тРНК^), был получен с помощью нуклеотидилтрансферазной реакции присоединением s^UMP к транскрипту тРНК^, укороченному на два нуклеотида методом ступенчатой деградации. Тиолированные транскрипты тРНК^" являются субстратами фенилаланил-тРНК-синтетазы. Включение 1-2 остатков s^U на молекулу тРНК не влияет на эффективность аминоацилирования, тогда как полная замена 16 остатков U на s^U уменьшает на порядок величину Кщ и незначительно величину V. Аналог [s^U - 75]-тРНК""", не имеющий концевого аденозина, не аминоацилируется, но является эффективным конкурентным ингибитором реакции аминоацилирования. При облучении УФ-светом наблюдается ковалентное присоединение тиолированных аналогов тРНК"^ к ферменту. При модификации происходит инактивация фермента, которая следует параллельно процессу ковалентного присоединения. Уровень модификации соответствует стехиометрии связывания тРНК функциональным димером. Анализ продуктов модификации с помощью SDS-электрофореза показывает, что в присутствии тиолированных транскриптов тРНК метятся преимущественно (70-80% от общей модификации) малые (х-субъединицы синтетазы. Уровень модификации Р-субъединиц в 6 раз ниже. В случае полностью тиолированного аналога образуются продукты "сшивки" субъединиц. Модификация синтетазы аналогом [s^U - 75]тРНК^ приводит к мечению исключительно Рсубъединиц. В присутствии нативной тРНК"^ снижается уровень модификации фермента, при этом в равной степени защищаются оба типа субъединиц. Наблюдаемый защитный эффект зависит от концентрации тРНК^ и указывает на аффинный характер модификации. Впервые исследована субстратная активность аналогов тРНК, присоединенных ковалентно к синтетазе. Показано аминоацилирование тиолированных транскриптов тРНК^ в ковалентном комплексе с ферментом, что свидетельствует в пользу высокоселективного мечения.

Авторы:

Издание: Молекулярная биология
Год издания: 1998
Объем: 2с.
Дополнительная информация: 1998.-N 2.-С.372-373
Просмотров: 50