РЕАКЦИЯ ЭНДОТЕЛИЯ НА ВОЗДЕЙСТВИЕ ХИМИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ И ИММУНОМОДУЛЯТОРОВ

Аннотация:

Многочисленные клинические наблюдения свидетельствуют о том, что у больных с опухолями различных локализаций на фоне проводимого лечения довольно часто развиваются тромботические осложнения. Одной из причин этого специалисты считают активацию гемостатических свойств под влиянием различных стимулов, как внутренних, так и внешних. Показано, что эндотелиальные клетки синтезируют и накапливают фактор Виллебранда (ФВ) в тельцах Вайбеля-Паллада и способны в течение 10 мин выделять свое содержимое под влиянием различных агентов (тромбина, фибрина, серотонина, эстрогенов) [12, 19, 26, 32] - ФВ отводят важную роль в развитии патологических состояний, проявляющихся как кровотечениями, так и тромбозами [5,9]. Учитывая, что эндотелий является основным местом синтеза ФВ, логично предположить взаимосвязь изменения его уровня в циркуляции и состояния сосудистой стенки. Практически все авторы, изучавшие изменение концентрации ФВ при воспалительных и инфекционных заболеваниях, наблюдали прямую зависимость между активностью патологического процесса и степенью повышения уровня этого белка в плазме крови, что позволило отнести ФВ к белкам острой фазы воспаления [8, 29]. При развитии опухоли, даже вне зависимости от каких-либо специфических иммунных реакций на нее, наблюдается активация клеток иммунной системы из-за присутствия значительной массы гибнущих клеток и вторичных инфекций. Это сопровождается продукцией исключительно широкого спектра биологически активных веществ, которые также могут оказывать влияние на эндотелиальную выстилку сосудов [1, 6]. Наиболее мощными продуцентами таких биологически активных веществ являются моноциты и макрофаги [1]. Использование химиопрепаратов для лечения злокачественных новообразований также сопряжено с увеличением риска тромботических осложнений. Хотя непосредственная связь между воздействием того или иного химиотерапевтического препарата и возникновением процессов тромбообразования пока не ясна, но, учитывая тот факт, что химиотерапевтическое лечение часто вызывает повышение содержания ФВ в крови больных и последующие тромботические осложнения [10, 16, 18, 31], можно предполагать возникновение повреждений или возбуждения эндотелиальных клеток. отвечающих на это выделением ФВ в кровоток. Кроме того, многие химиотерапевтические препараты, прямая иммуномоделирующая функция которых хорошо известна, являются достаточно сильными активаторами иммунной системы, в частности моноцитов и макрофагов [20]. В связи с вышеизложенным представляется целесообразным рассмотреть возможную реакцию эндотелиальных клеток на воздействие продуктов активированных макрофагов и некоторых химиотерапевтических средств для выяснения механизмов развития тромботических осложнений, связанных с активацией свертывающей системы крови у онкологических больных. Материал и методы. В работе использована первичная культура эндотелиальных клеток, выделенных и стерильных условиях из пуповинной вены по методу Jaffe и соавт. [14]. Пуповину отделяли от плаценты здоровой роженицы, не позже чем через 3 ч промывали пуповинную вену раствором Хенкса и затем наполняли 0,2% раствором коллагеназы ("Sigma"). После 30 мин инкубации при 37°С эндотелиальные клетки были выделены, отмыты в растворе Хенкса с 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и высажены в 96-луночные планшеты ("Flow"), покрытые предварительно 0.1% раствором желатина ("Sigma"). Клетки содержались при 37°С в 5% СО2 и 100% влажности. Для культивирования эндотелиальных клеток использовали среду 199 ("Sigma"), содержащую 20% эмбриональной сыворотки, 20 мкг/мл фактора роста эндотелия ("Sigma"), 90 U/мл гепарина. 50 мкг/мл гентамицина и 2,5 мкг/мл фунгизона ("Gibco"). Эндотелиальные клетки культивировали 6-7 дней до формирования монослоя, после чего отделяли от подложки при помощи 0,025% трипсина-EDTA ("Gibco") и пересевали. Идентификацию эндотелиальных клеток проводили по методу Jaffe и соавт. [3] с использованием моноклональных антител к ФВ собственного производства [2]. Перитонеальные макрофаги мышей линии BALB/c (питомник "Рапполово" РАМН), активированные с помощью БЦЖ (Bacillus Calmette-Glierin. ИЭМ им. Н. Ф. Гамалеи. Москва), культивировали для получения кондиционированных сред (супернатантов) по методу, предложенному ранее [3]. Использовали кондиционированные среды с преимущественной цитотоксической или ростстимулируюшей активностью, которая оценивалась рутинным радиометрическим методом на клетках линии KB (карцинома полости рта человека) [4]. Эндотелиальные клетки инкубировали в течение 12 ч с супернатантами активированных макрофагов (МФ), которые добавляли вместо культуральной среды в лунки 96-луночных планшет, где эндотелиальные клетки достигли монослоя, после чего культуральную жидкость аспирировали и хранили при -70°С для дальнейшего иммуноферментного анализа. Жизнеспособность эндотелиальных клеток оценивали по активности лактатдегидрогеназы [28]. С этой целью эндотелиальные клетки после удаления культуральной среды промывали раствором Хенкса и затем разрушали однократным замораживанием-размораживанием. Лизаты клеток инкубировали последовательно с раствором никотинамид-аденин-динуклеотида, пирофосфорнокислого натрия и молочнокислого натрия при 37°С. Далее добавляли раствор 2,4-динитрофенилгидразина и гидроксида натрия, пробы перемешивали и измеряли оптическую плотность при длине волны 560 нм на спектрофотометре СФ-26 (ЛОМО, Ленинград). В качестве контроля использовали интактные клетки эндотелия. Параллельно проводили окрашивание клеток трипановым синим ("Sigma") и последующий подсчет количества погибших клеток в камере Горяева. Цисплатин и доксорубицин как представители двух групп химиотерапевтических препаратов алкилирующего действия и противоопухолевых антибиотиков, наиболее часто используемые в комбинированном лечении злокачественных опухолей. применяли в концентрациях, указанных S. Salmon [34]. Эндотелиальные клетки инкубировали с указанными химиопрепаратами, которые были добавлены в культуральную среду, в течение 8 ч, после чего она была подвергнута иммуноферментному анализу. Жизнеспособность эндотелиальных клеток оценивали аналогично. Уровень ФВ в супернатантах эндотелиальных клеток измеряли твердофазным иммуноферментным методом с использованием ранее разработанного набора [7].

Авторы:

Издание: Гематология и трансфузиология
Год издания: 1998
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 1998.-N 5.-С.19-23
Просмотров: 84