ТЕРМОФИЛЬНЫЙ ШТАММ BACILLUS SPECIES AA СОДЕРЖИТ НЕСКОЛЬКО САЙТ-СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ

Аннотация:

Сайт-специфические эндонуклеазы являются незаменимыми инструментами при конструировании рекомбинантных ДНК и анализе геномов. Несмотря на большое количество уже известных эндонуклеаз, исследования в этой области не теряют своей актуальности [1]. Нужны ферменты с новыми сайтами узнавания, большой интерес также представляют новые штаммы-продуценты ферментов известных прототипов. Прототипы известных ферментов из новых штаммов-продуцентов могут быть более стабильны при хранении или в отличие от них могут не обладать <штриховой> активностью. Словом, новые ферменты могут выгодно отличаться от их прототипов. При скрининге природных штаммов термофильных микроорганизмов обнаружен штамм Bacillus species AA, содержащий несколько сайтспецифических эндонуклеаз. Три из них (BspAAl, BspAAll, BspAAlll) выделены и охарактеризованы. Показано наличие как минимум еще одной сайт-специфической эндонуклеазы, охарактеризовать которую не удалось из-за низкого содержания в клетке. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использован природный изолят термофильной бактерии Bacillus species AA. Субстратные ДНК, использованные в работе, получены в нашей лаборатории. Выделение сайт-специфических эндонуклеаз, Культуру В .species AA выращивали на SOC-cpeде (2%-ный бактотриптон, 0,5%-ный дрожжевой экстракт, 10 мМ NaCI, 2,5 мМ КС1, 10 мМ MgClz, 10 мМ MgSO^, 20 мМ глюкоза, рН 6,0) до поздней логарифмической фазы при 48° с интенсивной аэрацией. Биомассу собирали центрифугированием при 4000 g в течение 30 мин. Собранные клетки промывали в буфере ТЕ, рН 8,0 (10 мМ Tris-HCI, рН 8,0, 1 мМ ЭДТА), повторно центрифугировали, хранили при -20°. Из 3,5 л суспензии собрано 23 г сырой биомассы. Для разрушения клеток оттаявшую биомассу ресуспендировали в 100 мл лизирующего буфера (20 мМ Tris-HCI, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид), добавляли 1 мл раствора лизоцима (14 мг/мл) в том же буфере, Инкубировали 15 мин в ледяной бане. Клетки разрушали на ледяной бане ультразвуковым дезинтегратором УЗДН-А - 10 импульсами в режиме 30 с импульс, 30 с пауза. Степень разрушения клеток контролировали по снижению мутности суспензии на нефелометре КФК-2-УХЛ при 590 нм. Суспензию освобождали от обломков клеток центрифугированием в течение 1 ч при 30000 об/мин в роторе Ti45 (, США) при 4°. Полученный супернатант (115 мл) собирали и очищали полиэтиленгликоль-декстрановой преципитацией в присутствии NaCI по методу Шлейфа [2]. После этого супернатант наносили на колонку с голубой агарозой (Институт химии АН Эстонии), объемом 18 мл, уравновешенную буфером А (10 мМ Tris-HCI, рН 7,4,

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 1998
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 1998.-N 5.-С.636-645
Просмотров: 36