БИОЛЮМИНЕСЦЕНЦИЯ СВОБОДНЫХ И ИММОБИЛИЗОВАННЫХ В КРИОГЕЛЕ ПОЛИВИНИЛОВОГО СПИРТА РЕКОМБИНАНТНЫХ КЛЕТОК ESCHERICHIA COLI, СОДЕРЖАЩИХ ЛЮЦИФЕРАЗУ СВЕТЛЯКОВ

Аннотация:

Исследована биолюминесценция рекомбинантных клеток Е.соИ, содержащих люциферазу светляков, в свободном и иммобилизованном в криогеле поливинилового спирта состоянии. Показано, что интенсивность и кинетика биолюминесцентного сигнала изменяются при иммобилизации клеток и зависят от концентрации внутриклеточного АТР и от проницаемости клеточных мембран. В настоящее время накоплен значительный экспериментальный материал, свидетельствующий об изменении биохимических и физиологических свойств при иммобилизации клеток микроорганизмов. Одним из наиболее быстрых и чувствительных способов оценки жизнеспособности клеток как в свободном, так и иммобилизованном состоянии является анализ внутриклеточного АТР биолюминесцентным методом с помощью реагентов на основе люциферазы светляков [1]. При этом на первой стадии анализа разрушают клеточную мембрану для полной экстракции внутриклеточного АТР, а затем анализируют концентрацию АТР в экстракте с помощью биолюминесцентного АТРреагента. Были получены рекомбинантные микроорганизмы, которые синтезируют все необходимые компоненты для протекания этой биолюминесцентной реакции, за исключением люциферина. Проникновение последнего в клетку инициирует реакцию, и клетки светятся. При нейтральных рН молекулы люциферина в растворе заряжены отрицательно и не могут проникать через мембрану. При подкислении внешней среды в результате протонирования карбоксильной группы доля нейтральных молекул люциферина, способных легко диффундировать внутрь клетки, увеличивается, и возникает интенсивная биолюминесценция [2]. Яркая биолюминесценция возникает также при обработке рекомбинантных клеток полимиксином при нейтральных рН. В этом случае в клеточной мембране образуются крупные поры, сквозь которые могут свободно диффундировать низкомолекулярные метаболиты. При оптимальных концентрациях полимиксина люцифераза светляков остается внутри клетки, а люциферин и АТР свободно проникают в клетку, не нарушая при этом ее жизнеспособности. Интенсивность свечения клеток пропорциональна содержанию внутриклеточного АТР [3]. АТР как один из важнейших клеточных метаболитов определяет энергетический статус клетки. На любые стрессовые воздействия клетка отвечает изменением внутриклеточной концентрации АТР [4]. Свечение рекомбинантных клеток можно рассматривать как своеобразный индикатор жизнеспособности клетки. Проблема изменения метаболизма клеток в результате иммобилизации, влияния матрицы на биохимические процессы в иммобилизованной клетке является весьма актуальной. Существующие эмпирические подходы к решению этой проблемы трудоемки и не обладают предсказательной силой,

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 1998
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 1998.-N 5.-С.684-689
Просмотров: 39