СТАБИЛИЗАЦИЯ ВИДИМЫМ СВЕТОМ МАКРОМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ ХРОМАТИНА В ПРИСУТСТВИИ БРОМИСТОГО ЭТИДИЯ

Аннотация:

Разработан метод индукции в хроматине изолированных ядер множественных ДНК-белковых и белок-белковых <сшивок>, вызываемых совместным действием флуорохрома бромистого этидия и видимого света (35()550 нм), выделенного из спектра ртутной лампы. Электронно-микроскопический анализ ядер, изолированных в растворах с различной концентрацией двухвалентных катионов, окрашенных бромистым этидием. облученных таким светом и подвергнутых воздействию факторов, декомпактизующих хроматин, показал, что предложенный метод селективно стабилизирует макромолекулярные комплексы хроматина, <элементарная> ДНП-фибрилла толщиной около 30 нм при таких режимах обработки не стабилизируется и после экстракции гистона Н 1 0.6 М NaCI переходит в нуклеосомнук) форму. Помимо комплексов хроматина в облученных ядрах стабилизируются также ядрышки и кластеры интерхроматиновых гранул. Электрофоретический анализ белков в контрольных и облученных ядрах показал, что основную роль в стабилизации комплексов хроматина играют негистоновые белки. Полученные данные обсуждаются в связи с предположениями о наличии в хроматине интерфазных ядер макромолекулярных комплексов хроматина, <промежуточных> по уровню компактизации между ДНП-фибриллой толщиной 30 нм и митотической хромосомой. Известно, что хромосомы эукариот представляют собой чрезвычайно лабильные, динамичные структуры, меняющие свою морфологию как in vivo (в процессе функционирования), так и in vitro (при их изоляции из клетки). В системе in vitro показано, что ультраструктура выделенных митотических хромосом и интерфазных ядер в значительной степени зависит от состава тех сред, в которых осуществлялось фракционирование материала (Belmont et а1., 1989). Нельзя исключить того, что наблюдаемые структурные модификации хромосом отчасти могут быть следствием экстракции некоторых минорных белков, участвующих в формировании макромолекулярных комплексов хроматина. В связи с этим для ультраструктурного и биохимического анализа изолированных хромосом критичным является возможно более полное сохранение их <нативности> в процессе выделения. Очевидно, что наиболее полной стабилизации хромосом можно добиться стандартными цитологическими приемами фиксации, например с использованием глутаральдегида. Однако после такой фиксации хроматин становится недоступным для биохимического анализа, так как происходит неспецифическое <сшивание> не только собственно хромосомного материала, но и окружающих его цитоплазматических и ядерных белков. К недостаткам химических методов стабилизации следует отнести также слабую селективность и плохую контролируемость степени воздействия. Помимо химической фиксации существуют эффективные приемы, с помощью которых можно ковалентно <сшивать> отдельные хромосомные белки с ДНК, например ионизирующая или УФ-радиация (Moutschen, 1976; Han et al" 1983; Bianchi et а1., 1985; Eisner et al" 1985; Boulikas, 1986; Guo et al" 1986; Баскаева, 1992). Перечисленные выше химические и физические методы используются в основном для изучения молекулярной организации хроматина.

Авторы:

Издание: Цитология
Год издания: 1998
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 1998.-N 4.-С.340-346
Просмотров: 37