КОНСЕРВАТИВНЫЕ УЧАСТКИ ГЕНАТЕРМОСТАБИЛЬНОГО ЭНТЕРОТОКСИНА ENTEROBACTERIACEAE -ПРИНЦИПИАЛЬНАЯ ВОЗМОЖНОСТЬ ИХ ПРАКТИЧЕСКОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ

Аннотация:

Проведен анализ нуклеотидных последовательностей, связанных с продукцией условно патогенными представителями Enterobacteriaceae термостабильных энтеротоксинов (ST). Обнаружен консервативный участок длиной до 30 пар нуклеотидов на 3'-конце всех имевшихся в банке ST-генов, ответственный за энтеротоксичность молекулы ST-токсина. На его основе синтезированы 3 олигонуклеотида, 2 из которых использованы в качестве праймеров в опытах по амплификации ДНК энтеротоксигенных штаммов Citrobacter spp., Escherichia coli и Yersinia spp., а третий - в качестве зонда в экспериментах по дот-блот гибридизации с ДНК указанных культур. Предлагается универсальная диагностическая тест-система, позволяющая выявлять ST-энтеротоксин условно патогенных энтеробактерий вне зависимости от их видовой принадлежности МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Использовали 10 эталонных (337, 374, 645, 1181, 1349, 2546, 5565, 2903,2741,9554) и 5 клинических (3-3, 3-4, 402, 724, 762) штаммов Escherichia coli; 3 эталонных штамма (29/2, 192/1, 412/1) Yersinia enterocolitica; 1 клинический (348) штамм Citrobacter diversus и 19 клинических штаммов C.freundii (568,590,611,719,771,795, 843, 901, 903, 909, 44, 104, III, 120, 181, 220, 221, 253, 294). Клетки культивировали при 37° С в жидкой LB-среде в течение 18 ч, 1 мл суспензии клеток осаждали при 12000 об./ мин на центрифуге (Россия). Осадок ресуспендировали и разводили в буфере, содержащем 50 мМ КС1, 10 мМ трис-HCI (рН 8,4), 2,5 мМ MgCI^ 0,01% желатин, до конечной концентрации 10* КОЕ/мл. Лизирование осуществляли лизоцимом в концентрации 1 мг/мл в течение 15 мин при 22-25° С с последующим добавлением протеиназы К (, Германия) до конечной концентрации 200 мкг/ мл и инкубированием в течение 30 мин при 60° С. Фермент инактивировали кипячением в течение 15 мин. Хранение образцов перед использованием осуществляли при 4° С. Амплификация проводилась при использовании 20 мкл реакционной смеси следующего состава: 50 мМ КС1, 10 мМ трис-HCI (рН 8,4), 2,5 мМ MgCI^, 0,1% тритон-Х-100, 0,2 мМ каждого из dAT(t>, drr(t), йТТФ, dIJTO, 2,0 мМ/л праймера, 1,5 U Taq ДНК-полимеразы, 5 мкл бактериального лизата. После предварительной денатурации в течение 5 мин при 94° С осуществлялось 30 циклов амплификации при следующих условиях: 40 сек при 94° С, 90 сек при 46° С, 90 сек при 72° С на термоциклере фирмы (США). 10 мкл реакционной смеси после амплификации анализировали электрофоретически в 1,5% агарозном геле. В качестве маркеров использовали ДНК фага лямбда, рестрицированную Bst Е2 (М1), и 123 пн - лестница (США) (М2). ДНК окрашивали бромидом этидия и фотографировали при освещении ультрафиолетовыми лучами (254 нм) на трансиллюминаторе. Для осуществления дот-блот гибридизации ДНК наносили на нитроцеллюлозный фильтр, при этом ее количество соответствовало содержанию в W- 10' КОЕ/мл. Фиксацию ДНК на фильтре производили при 80° С под вакуумом. В качестве генетического зонда использовали сконструированный нами ЗО-членный олигонуклеотид, подобранный на основании анализа аминокислотных и нуклеотидных последовательностей, соответствующих высококонсервативному участку генов известных в настоящее время ST-энтеротоксинов энтеробактерий. Радиоактивно метили по 5'-концу (гамма-"Р). Гибридизацию с олигонуклеотидным зондом и последующую отмывку фильтра производили при 55° С по методике [12]. Высушенный фильтр радиоавтографировали в течение 18 ч.

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 1998
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 1998.-N 5.-С.36-39
Просмотров: 56