ОПЫТ ПРОВЕДЕНИЯ ПЦР ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИИ G1691- А В ГЕНЕ КОАГУЛЯЦИОННОГО ФАКТОРА V С ЦЕЛЬЮ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ АПС-РЕЗИСТЕНТНОСТИ ПРИ ВЕНОЗНОМ ТРОМБОЗЕ

Аннотация:

Ветупление: Венозный тромбоз является одним из наиболее серьезных проявлений дисрегуляции свертывающей системы крови и представляет важную проблему гематологии. Частота его возникновения очень высока - в среднем, один случай на каждую тысячу жителей ежегодно [3], что определяет необходимость поиска надежных маркеров предрасположенности к данному заболеванию с целью принятия своевременных профилактических мер в <группах риска>. К настоящему времени установлено, что наиболее частой причиной развития венозных тромбозов является наследственная тромбофилия, одна из форм которой обусловлена устойчивостью к активированному протеину С (АПС-резистентность) и обнаруживается у 20-60% больных данной патологией [3]. В подавляющем большинстве случаев АПС-резистентность обусловлена единичной аминокислотной (Ак) заменой Arg506 -> Gin в коагуляционном факторе V, которая, в свою очередь, является следствием точковой мутации G->А в позиции 1691 гена фактора V [2]. Указанная Ак замена затрагивает сайт специфического протеолиза фактора V под действием АПС. Таким образом, АПС-резистентность в случае мутации G1691 -> А в гене фактора V является следствием неэффективной протеолитической инактивации данного фактора, что приводит к нарушению отрицательной обратной связи в сложном каскаде тромбообразования [2]. Технология полимеразной цепной реакции (ПЦР) является наиболее оптимальным методом для скрининга генетических дефектов в клинической практике. Большинство ПЦР-тестов, предложенных для выявления мутации G1691 -> А, включают в себя, помимо амплификации участка гена фактора V, содержащего сайт мутации, последующую обработку продукта ПЦР (амплификата) специфичной эндонуклеазой - <рестриктазой> [2,4,6]. Данный подход широко используется для выявления <фиксированных> точковых мутаций, создающих, либо элиминирующих в нуклеотидной последовательности исследуемого гена место гидролиза (<сайг рестрикции>) для какой-либо рестриктазы. В случае нуклеотидной замены G1691 А в гене фактора V элиминируется сайт рестрикции фермента Мп1 1, поэтому большинство описанных в литературе методов идентификации данной мутации включают этап обработки амплификата именно этойрестриктазой [2,6]. Недавно Gandrille S. и соавт. [4] был предложен другой метод ПЦР-детекции мутации G1691->А, основанный на том, что за счет использования модифицированного праймера в результате амплификации "мутантного" аллеля в амплификате направленно создается сайт рестрикции эндонуклеазы Hind III, тогда как в продукте "нормального" аллеля этого сайта не образуется. Поэтому обработка продукта ПЦР рестриктазой Hind III позволяет четко идентифицировать нормальный и мутантный аллели гена фактора V. В связи с тем, что рестриктаза Hind III значительно дешевле и доступнее, по сравнению с ферментом Мп1 1, мы в своей работе использовали метод Gandrille S. и соавт. для диагностики мутации G1691> А в гене коатуляционного фактора V. Материалы и методы: В ходе работы было обследовано 17 больных с острым венозным тромбозом, 12 пациентов с постгромботической болезнью (ПТБ), а также 33 пациента с варикозным расширением вен, находившихся на амбулаторном или стационарном лечении в клинике Российского НИИ гематологии и трансфузиологии в течение 1997 года. Выделение геномной ДНК из 5-7 мл периферической крови проводили по методу Miller S.A. и соавт. [5]. 50100 нг ДНК амплифицировали в 15 мкл ПЦР-смеси, содержащей 67 мМ Трис-HCI, рН 8,8; 1,5 мМ MgC12; 16,6 мМ сульфат аммония; 0,01 % Твин-20; 200 мкМ каждого из дезоксирибонуклеотидтрифосфатов; 500 нМ каяедого из праймеров FV-IOA и FV-506 [4] и 0,75 ед. Taq-полимеразы (Биомастер, Москва) в следующем режиме: 95 °С - 1 мин, 58 °С - 1 мин, 72 °С - 1 мин. После 35 циклов ПЦР 10 мкл реакционной смеси инкубировали с 15 ед. фермента Hind III ("Сибэнзим", г.Новосибирск) в соответствующем буфере при 37 °С. Конечный объем реакции составлял 20 мкл, инкубацию вели в течение 2 часов. Продукты рестрикции анализировали с помощью электрофореза (ЭФ) в 8 % полиакриламидном геле (ПААГ). Фрагменты ДНК визуализировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания геля бромистым этидием (1 мкг/мл). Мутированному аллелю гена фактора V соответствовали фрагменты ДНК размером 209 пар нуклеотидов (пн) и 32 пн (последний не удавалось идентифицировать в геле вследствие его большой электрофоретической подвижности), тогда как нормальному аллелю соответствовал нативный, т.е. нерестрицированный, амплификат размером 241 пн.

Авторы:

Издание: Вестник службы крови России
Год издания: 1998
Объем: 2с.
Дополнительная информация: 1998.-N 3.-С.26-27
Просмотров: 124