ЭНДОНУКЛЕАЗА РЕСТРИКЦИИ EcoRII ГИДРОЛИЗУЕТ ОДИН ИЗ ДВУХ УЧАСТКОВ УЗНАВАНИЯ В ДНК, ФОРМИРУЮЩИХ КАТАЛИТИЧЕСКИЙ КОМПЛЕКС

Аннотация:

Для исследования двухсайтового механизма узнавания ДНК эндонуклеазой рестрикции EcoRII, который предполагает наличие в каталитическом комплексе четырех межнуклеотидных связей, потенциально расщепляемых ферментом, изучен гидролиз 71-звенных субстратов, содержащих два участка узнавания EcoRII Показано, что фермент гидролизует в одном фермент-субстратном комплексе только две фосфодиэфирные связи. Чтобы решить вопрос о том, принадлежат ли обе связи одному участку узнавания или разным, в одном из участков узнавания 71-звенных дуплексов гидролизуемые фосфодиэфирные связи заменяли на негидролизуемые пирофосфатные: поочередно или одновременно в обеих цепях. Это позволяло выключать соответствующие связи из гидролиза. Обнаружено, что эндонуклеаза EcoRII одновременно расщепляет две межнуклеотидные фосфодиэфирные связи, принадлежащие одному участку узнавания. Эндонуклеаза рестрикции EcoRII (R.EcoRII) узнает и расщепляет в ДНК нуклеотидную последовательность 5'(CC(A/T)GG. Изучение взаимодействия R.EcoRII с широким набором природных ДНК и синтетических аналогов субстратов привело к открытию двухсайтового механизма действия этого фермента [1-6]. Его особенность заключается в необходимости одновременного взаимодействия фермента с двумя участками узнавания в ДНК для формирования каталитического комплекса. Это свойство EcoRII обусловливает устойчивость к расщеплению протяженных субстратов с одним участком узнавания, а также возможность активации их гидролиза короткими субстратами (индукторами) [1-4]. Взаимодействие эндонуклеазы EcoRII с двумя участками узнавания, расположенными в разных молекулах ДНК, было названо транс-активацией [3]. Изучение стехиометрии активного комплекса R.EcoRII с ДНК показало, что фермент-субстратный комплекс состоит из двухсубъединичной формы фермента и двух участков узнавания [5]. Использование синтетических ДНК-дуплексов, в которых модифицированы расщепляемые эндонуклеазой EcoRII фосфодиэфирные связи, позволяет получить информацию о механизме действия этого фермента [3, 4]. Замена в участке узнавания фосфодиэфирных связей, гидролизуемых R.EroRII, на пирофосфатные приводит к блокированию гидролиза [7, 8]. Однако модификации такого типа не препятствуют формированию специфического фермент-субстратного комплекса [9]. Настоящая работа посвящена изучению механизма взаимодействия эндонуклеазы рестрикции EcoRII с двумя участками узнавания в ДНК, а именно, решению вопроса о количестве связей, одновременно гидролизуемых в составе одного фермент-субстратного комплекса, и о том, направлено ли это расщепление на один или на разные участки узнавания.

Авторы:

Издание: Молекулярная биология
Год издания: 1998
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 1998.-N 5.-С.793-796
Просмотров: 59