СТРЕССОВЫЕ ГРАНУЛЫ В КЛЕТКАХ С ИНТАКТНЫМИ ИЛИ РАЗРУШЕННЫМИ МИКРОТРУБОЧКАМИ: АНАЛИЗ С ПОМОЩЬЮ НОВОГО АЛГОРИТМА ОБРАБОТКИ ВИДЕОИЗОБРАЖЕНИЙ

Аннотация:

Стрессовые гранулы (СГ) — временные РНП-структуры, возникающие в клетках при стрессе. Для их изучения применяют в основном флуоресцентно-микроскопические методы с последующим количественным анализом клеточных изображений. Нами разработан новый алгоритм автоматического выявления СГ на неравномерном фоне цитоплазмы культивируемых животных клеток. С помощью этого алгоритма получены данные, свидетельствующие об образовании видимых СГ в клетках по принципу «все или ничего» и об относительном постоянстве их количества в клетках. Также показано, что разрушение клеточных микротрубочек приводит к уменьшению среднего размера СГ и увеличению их количества в клетке. Ключевые слова: стрессовые гранулы, иммунофлуоресцентная микроскопия, анализ изображений, микротрубочки, РНП. Стрессовые гранулы (СГ) — скопления РНП в цитоплазме животных клеток, наблюдающиеся после воздействия стрессовых факторов, например теплового шока, окислительного стресса и ультрафиолетового облучения . После прекращения стрессирующего воздействия СГ рассасываются. В состав СГ входят мРНК, большое количество РНК-связывающих белков, факторы инициации трансляции elFl, eIF3, eIF4F и малая рибосомная субъединица. Большая рибосомная субъединица, а также факторы инициации трансляции eIF5 и eIF2 исключаются из СГ. Предполагается, что образование СГ является следствием ингибирования трансляции на стадии инициации, в частности за счет фосфорилирования eIF2a. В результате этого фосфорилирования в клетке резко снижается количество тройственного комплекса и на 5'-концах мРНК собирается неканонический инициаторный комплекс, не содержащий тройственного комплекса. Получающиеся мРНП-частицы объединяются в цитоплазме в СГ (Kedersha et al., 2002). Несмотря на достаточно интенсивные исследования, механизмы объединения РНП при образовании СГ и биологический смысл образования СГ в клетках остаются непонятными. СГ являются очень рыхлыми структурами. Несмотря на достаточно продолжительную историю их исследования, попытки выделить их in vitro оказались неудачными. СГ изучают в основном методами световой микроскопии, используя иммунофлуоресцентное окрашивание, экспрессию в клетках белков-маркеров СГ, слитых с флуоресцентными белками, гибридизацию с ДНК-зондами. Изучение числа, размера и расположения в клетке СГ при различных временах и интенсивностях стрессового воздействия, а также при дополнительных воздействиях на клетки, например при разрушении микротрубочек, играет основную роль в исследовании механизмов формирования СГ. Обычно при исследовании числа и размера СГ их либо подсчитывают вручную, что очень трудоемко и таит в себе опасность влияния человеческого фактора на результаты подсчета, либо применяют анализ микроскопических фотографий с помощью компьютерных программ. К сожалению, основные существующие в настоящее время программы анализа изображений (ImageJ, открытая программа, http://imagej.nih.gov/ij) и MetaMorph (Molecular Devices, Inc., США) не используют алгоритмов, которые могли бы решить проблему подсчета СГ. При компьютерном анализе для подсчета частиц обычно бинаризуют фотографию при помощи постоянного для всего изображения порога, как, например, это сделано в работе (Zurla et al., 2011). Для реальных фотографий клеток с СГ это во многих случаях оказывается неприемлемым, поскольку большинство компонентов СГ локализуется также и диффузно в цитоплазме и яркость фонового окрашивания в центре клетки может быть выше, чем яркость видимой гранулы на периферии клетки. При бинаризации подобной фотографии центрально расположенные гранулы сливаются друг с другом либо при выставлении другого порога пропадают периферические гранулы. В нашей работе мы предлагаем алгоритм для автоматизированного распознавания изображения СГ.

Авторы:

Издание: Цитология
Год издания: 2012
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2012.-N 7.-С.560-565. Библ. 10 назв.
Просмотров: 152