ИНЖЕНЕРИЯ СУБСТРАТНОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ ОКСИДАЗЫ D-АМИНОКИСЛОТ Trigonopsis variabilis: НАПРАВЛЕННЫЙ МУТАГЕНЕЗ ОСТАТКА Phe258

Аннотация:

Природные оксидазы D-аминокислот (DAAO) обладают широким спектром субстратной специфичности и поэтому они непригодны для селективного определения отдельных D-аминокислот. Для получения DAAO из дрожжей Trigonopsis variabilis (TvDAAO) с более узкой специфичностью был проведен анализ трехмерной структуры фермента, который показал, что на поверхности белковой глобулы находится остаток Phe258, контролирующий вход субстратов в активный центр. Остаток Phe258 был заменен на остатки Ala, Ser и Туг. Мутантные TvDAAO с заменами Phe258Ala, Phe258Ser и Phe258Tyr были очищены до гомогенного состояния и были изучены их термостабильность и каталитические свойства. Введение вышеуказанных аминокислотных замен приводит как к небольшой стабилизации (Phe258Tyr), так и дестабилизации фермента (Phe258Ser), причем изменение величины периода полуинактивации составляет не более двух раз. В то же время эти замены привели к резкому изменению спектра субстратной специфичности. Увеличение размера боковой группы за счет замены Phe258Tyr приводит к ухудшению каталитической эффективности практически со всеми изученными D-аминокислотами. В случае двух других замен наблюдается резкое сужение спектра субстратной специфичности. Улучшение каталитической эффективности наблюдается только в случае D-Tyr, B-Phe и D-Leu, а для остальных D-аминокислот она, наоборот, резко снижается. Для TvDAAO Phe258Ala улучшение каталитической эффективности с D-Туг, D-Phe и D-Leu составляет 3,66, 11,7 и 1,5 раза, а для мутантной TvDAAO Phe258Ser — 1,7, 4,75 и 6,61 соответственно.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2012
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2012.-N 10.-С.1423-1432. Библ. 24 назв.
Просмотров: 31