СТАБИЛИЗАЦИЯ РЕКОМБИНАНТНОЙ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ИЗ СОИ Glycine max МЕТОДОМ РАЦИОНАЛЬНОГО ДИЗАЙНА

Аннотация:

Рекомбинантная формиатдегидрогеназа из сои (SoyFDH) имеет самые низкие значения констант Михаэлиса как по субстрату, так и коферменту, но уступает по термостабильности формиатдегидрогеназам из других источников. Для получения мутантных SoyFDH, обладающих улучшенной термостабильностью, были проведены анализ пространственной структуры фермента и сравнение аминокислотных последовательностей ФДГ из различных источников. Методом направленного мутагенеза получено десять мутантных ферментов, которые были очищены и охарактеризованы. Термостабильность полученных мутантов исследовали двумя способами — по кинетике термоинактивации и с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии. В случае мутантных SoyFDH с заменами А267М и A267M/I272V(M1 и N12 соотвественно) происходило увеличение термостабильности. Эффект стабилизации зависел от температуры и при 52° для мутеинов М1 и М2 составил 3,6 и 11 раз соответственно. Данные дифференциальной сканирующей калориметрии подтверждают, что для мутантных SoyFDH Ala267Met и Ala267Met/Ile272Val произошло увеличение термостабильности по сравнению с исходной SoyFDH — положение максимума на кривой плавления (Тт) возросло на 2,7 и 4,6° соответственно. В случае замен L24D и VI27R произошло снижение стабильности: константы скорости термоинактивации при 52° возросли в 5 и 2,5 раза, а значения Тт уменьшились на 3,5 и 1,7 градуса соответственно. Для остальных мутантных SoyFDH с заменами G18A, К.23Т, К109Р, N247E, V281I и S354P термостабильность практически не изменилась. Данные по определению кинетических свойств показали, что в случае замен V127R и А267М происходит увеличение каталитической константы с 2,9 до 3,6 и 5,0 с-' соответственно, и снижение (улучшение) константы Михаэлиса по NAD+ с 13,3 до 9,5 и 9,9 мкМ соответственно.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2012
Объем: 14с.
Дополнительная информация: 2012.-N 10.-С.1443-1456. Библ. 23 назв.
Просмотров: 44