Хроматографическая очистка плазмидной ДНК для клинического применения (генной терапии)

Аннотация:

Для успешного применения плазмидных векторов в протоколах генной терапии необходима разработка методов получения гомогенных высокоочищенных препаратов рекомбинантной ДНК, не содержащих загрязняющих компонентов, в первую очередь хромосомной ДНК, бактериальных белков, РНК и эндотоксинов. В ходе проведенного исследования нами была проведена оптимизация способа очистки плазмидной суперскрученной ДНК с помощью трех хроматографических этапов из щелочного лизата бактериального штамма Е. coli. Были подобраны оптимальные условия для этапа щелочного лизиса в целях увеличения выхода плазмиды и минимизации длительности очистки с помощью гель-фильтрации. Ключевые слова: рекомбинантная ДНК, плазмида, гель-фильтрафия, анионообменная хроматография, высаливающая хроматография, генная терапия. В настоящее время векторные системы созданные на основе плазмид и вирусов применяют в различных протоколах генной терапии ряда заболеваний человека. Методы генной терапии основаны на введение в клетки векторов с генами, кодирующими терапевтические гены.В разрабатываемых схемах генной терапии, находящихся на разных стадиях клинических испытаний, на долю плазмидных векторов приходится 18% . Векторы на основе плазмид считаются наиболее безопасными по сравнению с вирусными системами доставки, поскольку после их введения в клетки не возникает выраженного иммунного ответа, а также отсутствует интеграция в геномом хозяйской клетки, что нивелирует возможный инсерционный мутагенез. В тоже время вопрос эффективной доставки и экспрессии генетического материала в составе плазмидных конструкций остается открытым. Вследствие этого для успешного лечения заболеваний необходимо введение большого количества препарата плазмидной ДНК или использование специфических систем их доставки. Стандартный метод получения плазмид из бактериальных клеток включает несколько ключевых этапов: наработка биомассы рекомбинантного бактериального штамма, лизис клеток, очистку плазмиды от геномной ДНК, РНК, белков и эндотоксинов клеток продуцента. В большинстве современных методов очистки плазмидной ДНК для разрушения клеточной стенки применяется щелочной лизис, который требует тщательного контроля, поскольку превышение времени контакта щелочи со суперскрученной плазмидной ДНК приводит к ее денатурации. Для дальнейшей очистки ДНК из щелочного лизата в основном применяют хроматографические методы-гель-фильтрацию, адсорбционную, ионно-обменную, аффинную, обращенно-фазную и хроматографию гидрофобных взаимодействий. Ряд хроматографических методов имеет существенные недостатки. Например, применение в качестве сорбента гидрок-силапатита ограничено тем, что он легко накапливает необратимо адсорбирующие вещества и может применяться лишь после удаления большей части балластного материала.Некоторые из методов, например, аффинная хроматография , не дают возможность увеличить масштабы производства из-за высокой стоимости сорбентов, а некоторые методы предполагают применение токсичных реагентов, как, например, при применении обращенно-фазной хроматографии ., что недопустимо для медицинских препаратов. В связи с чем, возникает потребность в методах получения высокоочищенных рекомбинант-ных ДНК, которые можно было бы масштабировать для производства медицинских препаратов нуклеиновых кислот в промышленных объемах.

Авторы:

Издание: Клеточная трансплатология и тканевая инженерия
Год издания: 2012
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2012.-N 3.-С.142-145. Библ. 9 назв.
Просмотров: 387