ЭКСПРЕССИЯ СИНТЕТИЧЕСКОГО ГЕНА ИНТЕРФЕРОНА-а8 ЧЕЛОВЕКА ПОД КОНТРОЛЕМ ПРОМОТОРА Pbad

Аннотация:

Рекомбинантный интерферон-а8 человека (rhlFN-a8) был получен путем экспрессии в Е. coli синтетического гена с оптимизированными кодонами, сконструированного с использованием двухступенчатой полимеразной цепной реакции (ПЦР). Ген, кодирующий человеческий интерферон-а8 (hlFN-a8), содержит большое количество «редких» кодонов. Они были заменены на кодоны, наиболее используемые в клетках Е. coli, а также было сбалансировано соотношение нуклеотидных пар TA-GC во всем гене интерферона. Двухступенчатая ПЦР была выполнена с помощью длинных (45-60 нуклеотидов) частично перекрывающихся праймеров и двух ДНК полимераз (pfu и GC-R1CH системы). В результате амплификации был получен ген, размером 504 пар нуклеотидов (п.н.), что соответствовало размерам последовательности, кодирующей IFN-a8; причем сама полимераза pfu была не способна амплифицировать ген нужного размера, а в составе продуктов ПЦР присутствовали аберрантные фрагменты. Полноразмерный ген был клонирован в экспрессионный вектор pBAD-TOPO, затем ориентация гена в конструкции была изменена путем обработки рестриктазой Ncol с последующим лигированием. Полученная в результате плазмида pBAD-TOPO-IFN-a8 (pBAD-IFNa8) содержала ген IFN-a8 под транскрипционным контролем промотора P с индексом bad, индуцируемого арабинозой. Для получения максимального выхода растворимого интерферона-а8, были подобраны оптимальные условия его экспрессии: концентрация L-арабинозы, температура и время индукции экспрессии. Экспрессированный lFN-a8 был охарактеризован в Ds-Na-ПААГ-электрофорезе и иммунохимическими методами. После хроматографической очистки рекомбинантного IFN-a8 на ДЭАЭ-сефарозе его выход составил 100 мг на 1л клеточной культуры. Дана сравнительная оценка антивирусной и противораковой активности lFN-a8 и IFN-a2a человека.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2012
Объем: 13с.
Дополнительная информация: 2012.-N 12.-С.1639-1651. Библ. 26 назв.
Просмотров: 70