ПРОСТОЙ МЕТОД ИЗМЕРЕНИЯ АКТИВНОСТИ СУПЕРОКСИДДИСМУТАЗЫ С ПОМОЩЬЮ ФОТОСЕНСИБИЛИЗИРОВАННОЙ ХЕМИЛЮМИНЕСЦЕНЦИИ

Аннотация:

Для определения активности СОД чаще всего используют фотометрические методы, в которых генерация супероксидных радикалов осуществляется с помощью НАДФ-Н оксидазы, или в ходе аутоокисления ряда веществ, таких как, например, адреналин. К недостаткам этих методов относятся необходимость строгого соблюдения рН, температуры, относительно продолжительное время проведения эксперимента, сложность подготовки материала для измерения. Предложенный метод определения активности СОД свободен от указанных недостатков. Он основан на фотосенсибилизированной рибофлавином хемилюминесцешщи люцигенина (ФХЛ). При этом ультрафиолетовое облучение рибофлавина приводит к генерации супероксидных радикалов, реакция которых с люцигенином сопровождается угнетаемой СОД хемилюминесценцией. Измерения проводились на приборе PhotochemR фирмы F.A.T. GmbH. Были подобраны минимальные концентрации компонентов системы, при которых интенсивность ФХЛ уже мало зависела от концентрации и была достаточна для проведения измерений: рибофлавин - 25 мкМ, люцигенин - 3 мкМ, метионин 250 мкМ. В этих условиях количество СОД, приводящее к 50% ингибированию сигнала ФХЛ было равно 10 (+-)0,3 Hr(Sigma, USA). Антиоксиданты, содержащиеся в крови, влияли на интенсивность ФХЛ, исходя из критерия 5% искажения результатов, в следующих концентрациях: аскорбиновая кислота > 3,6 мкМ, мочевая кислота > 0,3 мкМ, глутатион > 4мкМ. Принимая во внимание количество этих антиоксидантов в цельной крови и эритроцитах было рассчитано, что даже без отмывки эритроцитов их количество в пробе не оказывает влияния на результаты определения активности СОД. Было проведено сравнение предложенного метода с широко известньм методом фирмы CalbiochemR. Количество СОД, приводящее к двукратному уменьшению ФХЛ в нашем методе и в методе CalbiochemR было равно 10 и 40 нг (Sigma, USA), а стандартное отклонение составляло 0,45% и 0,96% соответственно. Была измерена активность СОД у 107 здоровых доноров (76 мужчин и 31 женщина, 40 человек - курильщики, 67-некурящие). Среднее значение активности фермента было 15,1(+-) 0,4нгСОД/1х10^9 эритроцитов.

Авторы:

Издание: Вопросы медицинской химии
Год издания: 1999
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 1999.-N 1.-С.70-79
Просмотров: 490