Определение геометрических размеров тромбоцитарных агрегатов in vitro методом цифровой микроскопии

Аннотация:

Экспериментально демонстрируются возможности метода цифровой микроскопии (МЦМ) для регистрации агрегации тромбоцитов плазмы крови от vitro на примере взаимодействия плазмы с индуктором АДФ. Показано, что МЦМ позволяет не только регистрировать тромбоцитарные агрегаты, но и определять распределение количества тромбоцитарных агрегатов по их геометрическим размерам, оценивать величину их среднего значения. Проведен анализ зависимости этих параметров тромбоцитарных образований от соотношения объемов взаимодействующих компонентов «индуктор-плазма», причем как для образцов плазмы с нормальным или повышенным содержанием тромбоцитов, так и для случаев тромбопении, а также для образцов плазмы со слабой агрегационной активностью тромбоцитов. Эксперименты показали, что метод МЦМ обладает высокой чувствительностью - он позволяет регистрировать агрегаты, состоящие всего лишь из нескольких тромбоцитов. В то же время для этого метода характерен большой динамический диапазон - он способен регистрировать как малые агрегаты, содержащие всего лишь несколько тромбоцитов, так и те, которые включают в себя сотни клеток. Исследование агрегации тромбоцитов (PLT - platelet) является важным инструментом для оценки наследственных и приобретенных дефектов в функционировании тромбоцитов. Измерение характеристик агрегации тромбоцитов используется для диагностики ряда заболеваний, анализа антиагрега-ционной способности фармакологических препаратов, оценки жизнеспособности тромбоцитарной массы при переливании крови и пр. Как правило, исследования PLT-агрегации проводятся с использованием следующих индукторов: коллаген (collagen), аденозин дифосфат (АДФ; ADP - adenosine diphosphate), арахидоновая кислота (arachidonic acid), тромбин (thrombin), ристоцетин (ristocetin).Немало работ посвящено подбору оптимального соотношения объема жидкости (плазма или цельная кровь), содержащей тромбоциты, и того или иного индуктора, а также определению стабильности работы индукторов, например, в зависимости от сроков и условий их хранения . Приборы для исследований процесса агрегации тромбоцитов (агрегометры) построены на ряде физических принципов и явлений, среди которых: турбидиметрия [3]-[5], импедансо-метрия [6], [7], нефелометрия, люминесцентный анализ [8], [9], проточная цитометрия. На практике измеряемыми параметрами агрегации являются: оптический коэффициент экстинкции образца или его импеданс, кинетика их изменения в процессе агрегации тромбоцитов, величина скорости процесса. В настоящее время существует множество агрегометров разного типа, например, серия приборов корпорации «Chrono-log», фирмы «Helena Laboratories», корпорации «Bio/Data», анализаторы агрегации тромбоцитов АР2110, а также отечественные приборы - анализатор агрегации тромбоцитов АТ-02 и серия приборов фирмы «Биола» [10]-[12]. Из зарубежных приборов представляются интересными [5], [13], где авторы предложили использовать принцип проточной цитометрии для регистрации агрегации тромбоцитов в цельной крови. Эти работы созвучны с [14]-[16], в которых подобные принципы используются для регистрации агглютинатов эритроцитов с целью определения группы крови исследуемого образца. По нашему мнению, крайне важно подчеркнуть, что независимо от избранного физического принципа явления приборы для исследования агрегации тромбоцитов осуществляют регистрацию агрегатов не прямым, а косвенным образом. Именно поэтому турбидиметрия требует, например, нахождения взаимосвязи между значением измеряемого оптического коэффициента экстинкции образца и состоянием смеси «плазма-индуктор». При этом следует отметить, что несмотря на свою популярность, этот метод не позволяет определять количество агрегатов и их размеры. Он способен лишь качественно описать кинетику агрегационного процесса, определить его скорость. И прежде всего это связано с тем, что исследуемые образцы (смесь «плазма-индуктор») могут иметь одно и то же значение оптического коэффициента экстинкции, несмотря на различие образцов в отношении количества сформированных агрегатов, распределения их по размерам, их средних геометрических размеров. Вот почему разработчики приборов повсеместно прибегают к процессу калибровки устройств перед проведением измерений. Даже в [11], [12], где впервые предложено оценивать средний размер тромбоцитарных агрегатов исследуемого образца плазмы, определяется не средний геометрический размер агрегатов непосредственно: за этот средний размер принимается некий параметр, пропорциональный отношению среднеквадратичного отклонения светопропускания образца к среднему значению коэффициента экстинкции исследуемой смеси [10]-[12]. Перечисленное требует поиска новых подходов к прямой, непосредственной регистрации тромбоцитарных агрегатов, позволяющих находить их распределение по размерам и, как результат, определять средний геометрический размер агрегатов исследуемого образца плазмы. Именно эта задача является целью рассматриваемой работы. Первая попытка авторов в этом направлении предпринята в [17], где обработка цифровых микроизображений осуществлялась «вручную». Особенность настоящей работы - визуализация цифровых изображений проб «индуктор-плазма» с последующей их компьютерной, программной обработкой.

Авторы:

Издание: Медицинская техника
Год издания: 2013
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2013.-N 3.-С.10-13. Библ. 10 назв.
Просмотров: 295