НАПРАВЛЕННАЯ ИСКУССТВЕННАЯ ЭВОЛЮЦИЯ АТРАЗИНХЛОРГИДРОЛАЗЫ И ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТНЫХ ФОРМ ФЕРМЕНТА, ОБЛАДАЮЩИХ ПОВЫШЕННОЙ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТЬЮ

Аннотация:

Атразинхлоргидролаза (AtzA, ЕС 3.8.1.8) привлекла внимание в связи с тем, что катализирует превращение ядовитого атразина в малотоксичный гидроксиатразин и может быть использована для биодеградации этого гербицида. Для поиска удачных разновидностей гена atzA в библиотеке случайных мутантов был применен метод селекции клонов, основанный на использовании одноклеточной водоросли Haematococcus pluvi-alis. В результате были получены восемь мутантных разновидностей фермента, обладающих повышенной каталитической активностью, превышающей активность AtzA «дикого» типа в 2,7—5 раз. Секвенирование показало, что две из этих активных форм содержали единичные точечные замены остатков Va112 и Leu395 соответственно. Другие усовершенствованные мутантные формы фермента несли замены одновременно в четырех аминокислотных остатках: Met315, His399, Asn429 и Val466, что свидетельствовало о важности всех шести остатков для активности AtzA. Анализ кинетики хлоргидролазной реакции показал, что пять мутантных разновидностей фермента имели Кm в 0,6—0,9 раз меньшую, а каталитическая эффективность (kcat/Кm) у всех восьми мутантных форм была в 2,5—4,1 раз более высокой по сравнению с «дикой» формой атразинхлоргидролазы. Моделирование трехмерной третичной структуры молекулы показало, что AtzA содержит домен (бета/альфа)8, характерный для надсемейства амидогидролаз, а также домен, состоящий из двух связанных между собой параллельных бета-слоев. Ион железа и пять взаимодействующих с ним аминокислотных остатков были локализованы в центральном бета-барреле домена (бета/альфа)8. Некоторые из вышеупомянутых аминокислотных остатков участвовали в формировании водородных связей внутри бета-слоя, соседствующего с доменом (бета/альфа).

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2013
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2013.-N 10.-С.1412-1421. Библ. 35 назв.
Просмотров: 29