ОПРЕДЕЛЕНИЕ МУТАЦИИ ЛЕЙДЕНА МЕТОДОМ ФЕРМЕНТАТИВНОГО УДЛИНЕНИЯ АЛЛЕЛЬ-СПЕЦИФИЧНОГО ПРАЙМЕРА С ДВОЙНОЙ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНОЙ ДЕТЕКЦИЕЙ (PED-БИОЛЮМ)

Аннотация:

Проведено сравнение метода выявления мутации Лейдена на основе РЕХТ реакции с последующим биолюминесцентным микроанализом продуктов с методом на основе ПЦР-РВ. Для тестирования были отобраны 83 образца геномной ДНК, в том числе 35 с известной гетерозиготной мутацией Лейдена. В качестве теста сравнения использовался коммерческий набор «SNP-экспресс-РВ» (НПО «Литех»). Показано, что предложенный подход представляет собой простой в исполнении, эффективный и относительно недорогой метод определения однонуклеотидного полиморфизма Лейдена в гене V фактора свертывания крови. Метод «PED-Биолюм» не отличается от коммерческого метода ПЦР-РВ по способности выявления мутантного аллеля и не уступает параметрам экономической эффективности. Однонуклеотидная замена (Single Nucleotide Polymorphism - SNP) в гене проакцелерина - пятого коагуляционного фактора (FV) по сайту 1691 G—>А (R506Q) (dbSNP: rs6025), известная как мутация Лейдена, придает устойчивость активной форме фактора V к протеолитическому действию активированного протеина С и является наиболее клинически значимым полиморфизмом плазменного гемостаза. Наличие мутации Лейдена в 3,7 раза повышает риск тромбоза глубоких вен, в 1,5 раза увеличивает риск развития инфаркта, в том числе в 2,8 раза у лиц без выраженного коронарного стеноза. Носительство данной мутации повышает вероятность развития целого ряда осложнений беременности. Экспертами ВОЗ носительство мутации Лейдена признано абсолютным противопоказанием к назначению оральных контрацептивов. Для выявления мутации Лейдена используют различные методы (аллель-специфическую гибридизацию, лигирование олигонуклеотидных фрагментов, рестриктазный анализ, реакцию удлинения праймера, различные модификации ПЦР и др.. В качестве альтернативного варианта предложена аналитическая технология, основанная на ферментативном удлинении аллель-специфичного праймера (primer extension reaction, РЕХТ-реакция) с последующей детекцией продуктов реакции с помощью биолюминесцентных меток на основе кальцийзависимых фотопротеинов (PED-Биолюм). Как было показано ранее, молекулярный анализ с использованием фотопротеинов в качестве репортерных молекул отличается высокой чувствительностью и простотой, метки на основе фотопротеинов доступны и стабильны. На основе двух генетических вариантов фотопротеина обелина, существенно различающихся по цвету и кинетике биолюминесцентных сигналов, был разработан метод одновременного анализа двух мишеней в одном образце. Целью работы явилась апробация и оценка аналитических и экономических характеристик разработанного одновременного метода PED-Биолюм в практике рутинного лабораторного тестирования.

Авторы:

Издание: Клиническая лабораторная диагностика
Год издания: 2013
Объем: 16с.
Дополнительная информация: 2013.-N 12.-С.26-41. Библ. 13 назв.
Просмотров: 88