НОВЫЙ МЕТОД ИММОБИЛИЗАЦИИ АРГИНАЗЫ I С ПОМОЩЬЮ ЦЕЛЛЮЛОЗОСВЯЗЫВАЮЩЕГО ДОМЕНА, ПОЛУЧЕНИЕ L-ОРНИТИНА

Аннотация:

Получен рекомбинантный штамм Escherichia coli pET35b-ARG, обладающий способностью к сверхэкспрессии аргиназы I, слитой с целлюлозосвязывающим доменом (ЦСД). Аргиназа I с помощью ЦСД была иммобилизована на целлюлозных микросферах. При проведении реакции в оптимальных условиях при 40°С, рН 9.5, в присутствии 1.0 мМ Мп2+, 30 мкл/мл иммобилизованного фермента и 30 г/л L-Apr в течение 1 ч степень конверсии L-Apr составила 98,7%. После 7-кратного использования в реакции 30 мкл иммобилизованного фермента в 1.0 мл раствора было получено 153 мг L-Орн 97,3%-ной чистоты. Полученные результаты показали эффективность разработанного метода иммобилизации и перспективность его использования для получения L-Орн. L-орнитин (L-Орн) — небелковая аминокислота, промежуточный метаболит в цикле мочевины. Аминокислота является предшественником при биосинтезе полиаминов, участвующих в клеточном росте и биосинтезе белка. L-Орн может также служить предшественников в биосинтезе нейромедиатора глутамата, который в свою очередь может быть предшественником ингибиторного нейромедиатора гамма-аминомасляной кислоты. L-Орн может также выполнять функции нейромедиатора. Существуют три основных способа промышленного получения L-Орн: химический синтез, синтез с помощью ферментов и ферментация микроорганизмов-продуцентов. При химическом синтезе получается смесь DL-форм аминокислоты, поэтому в дальнейшем необходимы дополнительные стадии очистки для получения биологически активного L-изомера. Ферментативный синтез получения L-Орн может ингибироваться продуктом реакции, кроме того исходные реагенты для ферментативного синтеза L-Орн не являются легкодоступными. Аргиназа (КФ 3.5.3.1) — конечный фермент цикла мочевины, может превращать L-аргинин (L-Apr) в мочевину и L-Орн. Аргиназы широко распространены в природе и присутствуют в различных организмах от бактерий до человека. У млекопитающих было обнаружено две изоформы аргиназы. Аргиназа I является цитозольным ферментом, который в значительном количестве экспрессируется в печени и катализирует большую часть специфичных для него реакций в организме. В качестве катализатора фермент должен обладать высоким уровнем активности, а также высокой селективностью и специфичностью и его получение может быть усовершенствовано до внедрения в промышленное производство. Метод иммобилизации явлется эффективным инструментом улучшения практически всех свойств фермента. В наших более ранних исследованиях, мы разработали новый метод иммобилизации белков на магнитных целлюлозных микросферах, используя предварительную модификацию белков путем слияния с целлюлозосвязывающим доменом (CBD). Преимуществами такого метода являются его удобство, простота и эффективность, а также отсутствие токсичных соединений. При иммобилизации фермента такой белок способен связываться с целлюлозными зернами посредством домена CBD. При разработке нового способа иммобилизации фермента была проведена также оптимизация концентрации реагентов для сшивки, исследованы условия проведения катализа иммобилизованным ферментом, возможность повторного использования фермента при оптимальных условиях. Наши результаты показали, что иммобилизация аргиназы I на микросферах является перспективным, экологически чистым методом производства L-Орн, который может иметь промышленное значение. Цель исследования — получение рекомбинантного штамма Escherichia coli, экспрессирующего модифицированный белок, содержащий целлюлозосвязывающий домен (CBD), и аргиназу I (CBD-ARG) и иммобилизация его на целлюлозных микросферах.

Авторы:

Издание: Прикладная биохимия и микробиология
Год издания: 2014
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2014.-N 1.-С.52-58. Библ. 16 назв.
Просмотров: 97