ПРИМЕНЕНИЕ МУЛЬТИПЛЕКС-ПЦР ДЛЯ РОДОВОЙ ИДЕНТИФИКАЦИИ БИФИДОБАКТЕРИЙ И ПРОПИОНИБАКТЕРИЙ

Аннотация:

Цель. Создание ПЦР тест-системы для определения бактерий класса Actinobacteria, относящихся к двум родам, наиболее широко представленным среди облигатно анаэробной микробиоты в кишечнике человека: Bifidobacterium и Pronionibacterium. Материалы и методы. Восемь штаммов бактерий Bifidobacterium spp. и 6 штаммоЬ бактерий рода Propionibacterium идентифицированы по морфологическим, культуральным и биохимическим свойствам. Выделение матричной ДНК штаммов для ПЦР проведено комплектом «ДНК-Экспресс» (НПФ «Литех», Россия). Праймеры для определения родовой принадлежности облигатных анаэробов разработаны на основе вариабельности гена 16S РНК с использованием программного обеспечения «Lasergene 7.1» («DNASTAR, Inc.», США). ПЦР-скрининг выделенной ДНК осуществлен на основе праймеров и реагентов ООО «Синтол». Детекцию ампликонов производили методом агарозного гель-электрофореза. Результаты. Мультиплексирование двух разных праймерных пар в одной пробе при температуре отжига 68°С в течение 30 циклов показало наличие неспецифических ампликонов, образующихся в пробах с ДНК-матрицей бифидобактерий. Повышение температуры отжига до 70°С и сокращение количества циклов ПЦР до 25 привело к исключению образования неспецифических ампликонов. Поскольку применяемая температура отжига достигла области значений, оптимальных для работы Тая-полимеразы,удалосьреализовать алгоритм двухфазной ПЦР. Это решение позволило достичь сокращения общего времени реакции до 45 минут. Дальнейшее повышение температуры отжига до 72°С и сокращение фазы элонгации вплоть до 15 секунд при 30 циклах ПЦР не привело к видимому снижению эффективности реакции. Заключение. Разработана ускоренная система идентификации бактерий родов Bifidobacterium и Pronionibacterium с помощью системы двухфазной множественной ПЦР. Полученная система является частью системы скрининговой идентификации основных родов и видов культивируемых облигатно анаэробных бактерий, выделяемых из биотопов кишечника человека.

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 2014
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2014.-N 5.-С.78-82. Библ. 10 назв.
Просмотров: 96