ФОТОАФФИННАЯ МОДИФИКАЦИЯ 80S РИБОСОМ ЧЕЛОВЕКА С ПОМОЩЬЮ АНАЛОГА мРНК-ПРОИЗВОДНОГО ГЕКСАРИБОНУКЛЕОТИДА pUUUGUU, НЕСУЩЕГО АРИЛАЗИДОГРУППУ НА ОСТАТКЕ ГУАНИНА

Аннотация:

Для фотоаффинной модификации 80S рибосом из плаценты человека использовали аналог мРНК производное гексарибонуклеотида pUUUGUU (несущего кодоны Phe и Val) с арилазидогруппой на остатке гуанина. Производное получено в две стадии: вначале UUUGUU алкилировали 4-[(М-2-хлорэтил-N-метиламино)]бензиламином, CIRCH2NH2. При этом по атому N7 остатка гуанина присоединялся остаток реагента с алифатической аминогруппой -RCH2NH2, по которой селективно вводили арилазидогруппу, обрабатывая N-гидроксисукцинимидным эфиром п-азидотетрафторбензойной кислоты. В опытах по модификации 80S рибосом использовали аналог мРНК, несущий метку -32Р на 5'-конце. При облучении комплексов производного pUUUGUU с 80S рибосомами и родственными тРНК мягким УФ-светом (380 > лямбда > 270 нм) наблюдали ковалентное присоединение аналога мРНК преимущественно к 40S субчастицам. Во всех случаях модифицировались как 18S рРНК, так и белки; соотношение степени модификации между ними зависело от типа комплекса. Сайт модификации 18S рРНК локализован с помощью гидролиза модифицированной рРНК РНКазой Н в присутствии 20-звенных дезоксирибоолигомеров, комплементарных различным последовательностям рРНК. В комплексах производного pUUUGUU с 80S рибосомами и Phe-TPHKPhe в Р-сайте (или с двумя тРНК одновременно) модификация 18S рРНК значительна, сайт присоединения аналога мРНК локализован в 3'-концевом фрагменте (нуклеотиды 1831-1869). В комплексе с Val-TPHK(val) в Р-сайте степень модификации рРНК существенно ниже; в этом случае идентифицировано два сайта 'сшивки - в 3'-концевом фрагменте (1831-1869) и в центральной части 18S рРНК (674-1196). Анализ белков с помощью одно- и двумерного гель-электрофореза показал, что во всех случаях модифицируется в большей степени белок S 15. В комплексе с Рпе-тРНК(phe0 в Р-сайте наблюдается также незначительная сшивка с белками S2 и S30, а с Val-TPHK(val)' в Р-сайте - с белками S2 и S6.

Авторы:

Издание: Молекулярная биология
Год издания: 1999
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 1999.-N 2.-С.174-182
Просмотров: 24