Полный текст
Е.Н. Сазонова1,2, Д.В. Яковенко1, О.А. Лебедько1,2, И.М. Мальцева3, С.С. Тимошин1
Цитопротективный эффект дигидрокверцетина в первичной культуре пульмональных фибробластов белых крыс в условиях оксидативного стресса
1Дальневосточный государственный медицинский университет, 680000, ул. Муравьева-Амурского, 35, тел. 8-(4212)-76-13-96, e-mail: nauka@mail.fesmu.ru;
2Институт охраны материнства и детства Хабаровского филиала Дальневосточного научного центра физиологии и патологии дыхания СО РАМН, 680022, ул. Воронежская, 49, корп. 1, тел./факс: 8-(4212)-35-63-35, 35-65-91, e-mail: iomid@yandex.ru;
3ООО "Медико-эстетический центр Биарриц", 680000, ул. Дзержинского, 71, тел. 8-(4212)-32-38-61, г. Хабаровск
Контактная информация: Е.Н. Сазонова, e-mail: sazen@mail.ru
Резюме:
Целью исследования было изучение характера влияния дигидрокверцетина (ДГК) на первичную культуру пульмональных фибробластов. 6-часовое воздействие ДГК (160 мкМ) на фибробласты индуцировало угнетение продукции клетками супероксид-радикала, уменьшение размеров ядер фибробластов и суммарной площади зон ядрышкового организатора на фоне стабильной пролиферативной активности культуры. 2-часовой оксидативный стресс (ОС), индуцированный воздействием раствора перекиси водорода (60мкМ), приводил к полной блокаде ДНК-синтетической активности фибробластов, при этом имело место достоверное уменьшение площади ядер фибробластов и суммарной площади зон ядрышкового организатора. На фоне ДГК имело место существенное снижение повреждающего действия ОС: интенсивность продукции супероксид радикала в культуре клеток стала достоверно ниже, была зарегистрирована ДНК-синтетическая активность фибробластов.
Ключевые слова:
оксидативный стресс, фибробласты, дигидрокверцетин
Е.N. Sazonova1,2, D.V. Yakovenko1, О.А. Lebed'ko1,2, I.М. Maltseva3, S.S. Timoshin1
Cytoprotective effect of dihydroquarcetine in the initial culture of pulmonary fibroblasts of albino rats exposewd to oxidative stress
1Far Eastern State Medical University;
2Research Institute of maternity and infancy protection;
3Medical-esthetic Center "Bioritz", Khabarovsk
Summary:
The goal of the research was to study the character of dehydroquarcetine (DHQ) effect on the initial culture of pulmonary fibroblasts. 6-hour exposure of DHQ (160 μM) on fibroblasts induced suppression of products by superoxide radicals, diminish sizes of fibroblasts nucleoli and a total square of nucleoli zone organizer at the background of stable proliferation of culture activity. 2-hour exposure of oxidative stress (ОS), induced by hydrogen peroxide solution (60μM), resulted in a complete blockade of fibroblasts DNA-synthetic activity, at the same time there occurred a reliable decrease of fibroblasts' nucleoli square and a total summarized zone square of nucleoli organizer. At the background of DHQ there was evidence of dramatic diminishing of a harmful effect of OS: intensity of superoxide radical production in the cell culture became reliably low. Fibroblasts DNA-synthetic activity was registered.
Key words:
oxidative stress, fibroblasts, dehydroquarcetine
Введение
Дигидрокверцетин - это растительный антиоксидант, полифенольный биофлавоноид [2]. В литературе описано антипролиферативное и цитотоксическое воздействие биологически активных веществ класса биофлавоноидов на культуры опухолевых клеток [5]. Вместе с тем, характер влияния биофлавоноида кверцетина и его аналогов на нормальные клетки может существенно отличаться от влияния на опухолевые клетки [7].
Целью исследования было изучение характера влияния дигидрокверцетина (ДГК) на первичную культуру пульмональных фибробластов на интактном фоне и в условиях оксидативного стресса.
Материалы и методы
Объектом исследования служила первичная культура пульмональных фибробластов новорожденной белой крысы линии Wistar. Биоптат правого легкого подвергали механической дезагрегации с последующей обработкой коллагеназой панкреаса краба (Биолот, Россия) - 500 ед./мл при 37 оС в течение 15 мин. После двукратной отмывки раствором Хенкса (Биолот, Россия), полученный материал высевали в культуральные флаконы. Культивирование проводили в среде DMEM (Биолот, Россия) с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки (Sigma, США) в газовой среде с 5 % содержанием СО2. Для исследования использовали клетки 5 пассажа.
Инкубацию пульмональных фибробластов с ДГК (Sigma Aldrich, США) проводили в течение 6 часов при концентрации вещества в культуральной среде 160 мкМ (50 мг/л). Оксидативный стресс моделировали добавлением в 15 мл инкубационной среды 0,001мл 3 % Н2О2 (60 мкМ) с экспозицией в течение 2 часов [3]. Формировали следующие серии: 1 - "контроль"; 2 - "ДГК" (воздействие ДГК в течение 6 часов); 3 - "оксидативный стресс" (добавление в культуральную среду Н2О2 с экспозицией в течение 2 часов); 4 - "ДГК + оксидативный стресс" (воздействие ДГК в течение 6 часов с обработкой культуры в заключительные 2 часа инкубации перекисью водорода).
Для оценки процессов генерации супероксид-анион радикалов пульмональными фибробластами использовали метод люцигенин-зависимой хемилюминесценции (ХМЛ) [1]. Регистрацию ХМЛ осуществляли на люминесцентном спектрометре LS 50B "PERKIN ELMER", сигнал стандартизировали с помощью встроенной программы "Finlab". Фибробласты снимали с подложки с помощью раствора трипсина-Версена (Биолот, Россия) и трехкратно отмывали раствором Хенкса. Подсчет клеток в суспензии фибробластов проводили в камере Горяева. Для хемилюминесцентого анализа использовали 1×106 клеток. Люцигенин ( N,N'-dimethyl-9,9'-biacridinium dinitrate; Sigma-Aldrich) добавляли в конечной концентрации 5 мкM. Определяли светосумму люцигенин-зависимого свечения (Sluc) за 5 минут, которую выражали в относительных единицах.
ДНК-синтетическую активность пульмональных фибробластов исследовали методом авторадиографии с 3Н-тимидином. В течение 1 часа клеточные монослои инкубировали при 37 оС в растворе Хенкса с добавлением 3Н-тимидина в концентрации 1 мкКюри/мл. После инкубации монослои тщательно промывали в растворе Хенкса и фиксировали в 96 % этаноле. Предметные стекла с монослоем фибробластов покрывали ядерной фотоэмульсией Ilford (Великобритания) и инкубировали при 4 оC в течение 28 суток. Затем проводили обработку проявителем Д-19, фиксировали в 33 % растворе гипосульфита натрия и окрашивали гематоксилином. Индекс меченых ядер (ИМЯ) рассчитывали на основании просмотра не менее 5 000 фибробластов каждого монослоя и выражали в процентах.
Параметры ядрышкового аппарата клеток оценивали с помощью компьютерной морфоцитометрии на анализаторе изображения "МЕКОС-Ц" в монослоях фибробластов, окрашенных азотнокислым серебром. Исследовали площадь ядер фибробластов, количество зон ядрышковых организаторов (ЯОР), суммарную площадь зон ЯОР в ядре. Площади ядер и зон ЯОР рассчитывали на основании измерения 50 клеток. Для анализа количества зон ЯОР просматривали 200 ядер фибробластов.
Результаты исследования обрабатывали с использованием программы "Statistica 6.0". Различия между контрольной и опытными сериями считали статистически достоверными при р<0,05, используя t-критерий Стьюдента. Всего в эксперименте было исследовано 24 монослоя фибробластов.
Результаты и обсуждение
Воздействие ДГК на первичную культуру пульмональных фибробластов (серия 2) индуцировало угнетение продукции супероксид-радикала: наблюдалось достоверное снижение интенсивности люцигенен-зависимой ХМЛ на 35,5 % (рис. 1). Показатель активности ДНК-синтетических процессов - индекс меченых ядер, характеризующий долю фибробластов в S-фазе клеточного цикла, - после воздействия ДГК не имел достоверных отличий от контрольного параметра (ИМЯ контроль - 30,69±3,70 %; ИМЯ ДГК - 26,33±2,90 %). Морфометрическое исследование ядер фибробластов выявило достоверное уменьшение их размеров на 9,5 % (таблица). Кроме того, мы наблюдали достоверное снижение суммарной площади зон ЯОР на 7,8 %. Количество зон ЯОР в ядрах фибробластов, подвергнутых воздействию ДГК, не отличалось от контрольного. Воздействие ДГК на размер ядер и ядрышковый аппарат фибробластов может быть обусловлено способностью биофлавоноидов ингибировать активность мембранной тирозинкиназы, необходимой для реализации эффектов ростовых факторов [8].
Таблица. Параметры ядрышкового аппарата в первичной культуре пульмональных фибробластов исследуемых экспериментальных серий Исследуемая серия Площадь ядра (мкм2) Суммарная площадь зон ЯОР (мкм2) Количество зон ЯОР
Контроль 218,60±4,39 17,03±0,39 3,95±0,07
ДГК 197,94±3,94* 15,70±0,37* 3,98±0,08
Оксидативный стресс 80,83±3,46* 8,24±0,46* 3,11±0,10*
ДГК + оксидативный стресс 126,07±5,91*,** 12,99±0,47*, ** 3,35 ± 0,10*
Примечание. * - р<0,05 по отношению к серии "контроль"; ** - р<0,05 по отношению к серии "оксидативный стресс".
Воздействие на культивируемые пульмональные фибробласты среды с 60 мкМ перекиси водорода (серия 3 - "оксидативный стресс") индуцировало достоверное повышение интенсивности люцигенен-зависимой ХМЛ в культуре на 78,3 % (рисунок). Выраженная активация процессов свободнорадикального окисления в культуре сопровождалась практически полным блоком ДНК-синтетических процессов в культуре: в монослоях клеток, подвергнутых воздействию оксидативного стресса, встречались лишь единичные меченые ядра, с минимальной интенсивностью метки. По мнению Davies K.J. (1999), при оксидативном стрессе происходит блокада синтеза ДНК с целью защиты генетического аппарата от оксидативного повреждения.
Рис. Интенсивность люцигенин-зависимой ХМЛ в суспензированной культуре пульмональных фибробластов новорожденных белых крыс: 1 - контроль; 2 - ДГК; 3 - оксидативный стресс; 4 - ДГК + оксидативный стресс
Примечание. * - р<0,05 по отношению к серии "контроль"; ** - р<0,05 по отношению к серии "оксидативный стресс".
В фибробластах, подвергнутых воздействию перекиси водорода, по сравнению с контролем, наблюдалось достоверное значительное (на 63 %) уменьшение показателя площади ядер фибробластов; снижение (на 51,6 %) суммарной площади зон ядрышковых организаторов, а также достоверное уменьшение количества зон ЯОР в ядрах фибробластов (таблица). По данным Mayer C., Grummt I. (2005) и Wnuk M., et al. (2008), оксидативный стресс угнетает синтез рибосомальной РНК, что выражается в отклонении параметров ядрышкового аппарата.
Выраженность изменений в первичной культуре фибробластов, индуцированных воздействием перекиси водорода, была несколько меньше в монослоях, предварительно инкубированных с ДГК (серия 4). Интенсивность люцигенин-зависимой ХМЛ в этих образцах культуры оставалась достоверно выше контрольного параметра (на 21,3 %), однако была достоверно (на 32 %) ниже аналогичного параметра группы "оксидативный стресс" (рисунок).
Аналогичная закономерность наблюдалась и при анализе размеров ядер и состояния ядрышкового аппарата у фибробластов, подвергнутых действию оксидативного стресса на фоне ДГК. Так, показатель площади ядер фибробластов и суммарной площади ядрышек клеток серии "ДГК+оксидативный стресс" был достоверно ниже контрольных параметров, однако, достоверно выше аналогичных показателей серии "оксидативный стресс" (таблица).
Особенно отчетливо цитопротективный эффект ДГК был заметен при анализе процессов синтеза ДНК в культуре фибробластов. Если в серии монослоев, подвергнутых воздействию перекиси водорода, мы наблюдали практически полное исчезновение ДНК-синтетической активности, то предварительное воздействие ДГК восстанавливало индекс меченых ядер культуры фибробластов до 6,56±1,50 %.
Результаты проведенного исследования в условиях первичной клеточной культуры указывают на наличие у растительного биофлавоноида дигидрокверцетина собственного прямого цитопротективного эффекта, реализующегося в условиях оксидативного стресса. Аналогичные по характеру эффекты были зарегистрированы Braganhol E., et al (2006) при исследовании влияния кверцетина на культуру нейронов гиппокампа [4]. Молекулярные механизмы цитопротективного влияния дигидрокверцетина в условиях оксидативного стресса требуют дальнейшего исследования.
Выводы
1.Влияние 160 мкМ ДГК на первичную культуру пульмональных фибробластов индуцирует угнетение продукции супероксид-радикала, достоверное уменьшение размеров ядер фибробластов и суммарной площади зон ЯОР.
2.Воздействие на культивируемые пульмональные фибробласты 60 мкМ перекиси водорода вызывает достоверную активацию продукции супероксид-радикала в культуре, блокаду ДНК-синтетической активности клеток и достоверное снижение площади ядер и суммарной площади зон ЯОР.
3.На фоне действия ДГК имеет место существенное снижение цитотоксического действия оксидативного стресса: уменьшается продукция супероксид-радикала, происходит частичное восстановление пролиферативной активности клеточной культуры.
Литература
1. Владимиров Ю.А., Проскурнина Е.В. Свободные радикалы и клеточная xемилюминесценция // Успехи биологической химии. - 2009. - Т. 49. - С. 341-388.
2. Меньшикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М.: Фирма "Слово", 2006. - С. 556.
3. Самохвалов В.А., Сметанина М.Д., Мусейкина Н.Ю. и др. Влияние низкой концентрации перекиси водорода на метаболизм клеток крови // Биомедицинская химия. - 2003. - Т. 2. - С. 122-127.
4. Braganhol E., Zamin L.L., Canedo D., et al. Antiproliferative effect of quercetin in the human U138MG glioma cell line // Anti-Cancer Drugs. - 2006. - Vol. 17 (6). - P. 663-671.
5. Csokay B., Prajda N., Weber G., Olah E. Molecular mechanisms in the antiproliferative action of quercetin // Life Sciences. - 1997. - Vol. 60 (24). - P. 2157-2163.
6. Davies K.J. The broad spectrum of responses to oxidants in proliferating cells: a new paradigm for oxidative stress // IUBMB Life. - 1999. - Vol. 48 (1). - P. 41-70.
7. Kim H.S., Quon Michael J., Kim Jeonga. New insights into the mechanisms of polyphenols beyond antioxidant properties; lessons from the green tea polyphenol,epigallocatechin 3-gallate // RedoxBiology. - 2014. - Vol. 2. - P. 187-195.
8. Liang Y.C., Lin-shiau S.Y., Chen C.F., Lin J.K. Suppression of extracellular signals and cell proliferation through EGF receptor binding by(-)-epigallo- catechin gallateinhuman A431 epidermoid carcinoma cells // J. Cell. Biochem. - 1997. - Vol. 67. - P. 55-65.
9. Mayer C., Grummt I. Cellular stress and nucleolar function // Cell Cycle. - 2005. - Vol. 4 (8). - P. 1036-1038.
10. O'Donnell V.B., Azzi A. High rates of extracellular superoxide generation by cultured human fibroblasts: involvement of a lipid-metabolizing enzyme // Biochem J. - 1996. - Vol. 318 (Pt 3). - P. 805-812.
11. Wnuk M., Lewinska A., Bugno M., Bartosz G., Slota E. Oxidant-induced decrease of the expression of nucleolar organizer regions in pig lymphocytes can be useful for monitoring the cellular effects of oxidative stress // Mutat Res - 2008. - Vol. 653 (1-2). - P. 124-129.
Дигидрокверцетин - это растительный антиоксидант, полифенольный биофлавоноид . В литературе описано антипролиферативное и цитотоксическое воздействие биологически активных веществ класса биофлавоноидов на культуры опухолевых клеток . Вместе с тем, характер влияния биофлавоноида кверцетина и его аналогов на нормальные клетки может существенно отличаться от влияния на опухолевые клетки .Целью исследования было изучение характера влияния дигидрокверцетина (ДГК) на первичную культуру пульмональных фибробластов. 6-часовое воздействие ДГК (160 мкМ) на фибробласты индуцировало угнетение продукции клетками супероксид-радикала, уменьшение размеров ядер фибробластов и суммарной площади зон ядрышкового организатора на фоне стабильной пролиферативной активности культуры. 2-часовой оксидативный стресс (ОС), индуцированный воздействием раствора перекиси водорода (60мкМ), приводил к полной блокаде ДНК-синтетической активности фибробластов, при этом имело место достоверное уменьшение площади ядер фибробластов и суммарной площади зон ядрышкового организатора. На фоне ДГК имело место существенное снижение повреждающего действия ОС: интенсивность продукции супероксид радикала в культуре клеток стала достоверно ниже, была зарегистрирована ДНК-синтетическая активность фибробластов.
Добавить в коллекцию