ЭКЗОСОМЫ СЛЕЗНОЙ ЖИДКОСТИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ: ВЫДЕЛЕНИЕ, ИДЕНТИФИКАЦИЯ И ХАРАКТЕРИЗАЦИЯ

Аннотация:

Экзосомы - тип внеклеточных везикул, являющихся переносчиками молекулярных сигналов в организме, а также несущих маркеры клеток-продуцентов. Целью данного исследования явилось выявление экзосом в слёзной жидкости (СЖ) здоровых людей, подтверждение их природы и изучение морфологических и молекулярно-биологических характеристик. Образцы СЖ однократно собирали у 24 здоровых доноров (45-60 лет), центрифугировали при 20000 g (15 мин) для осаждения клеточного дебриса. Супернатанты исследовали методом негативного контрастирования, а также использовали для выделения и очистки экзосом (ультрафильтрация через поры 100 нм, двойное ультрацентрифугирование (90 мин, 100000 g, 4°С). Полученные образцы исследовали методами электронной микроскопии и иммуноцитохимии, выделяли РНК и ДНК, определяли их размер капиллярным электрофорезом, определяли концентрацию и локализацию ДНК в экзосомах. Секвенирование ДНК проводили на секвенаторе MiSeq (Illumina), данные анализировали с помощью CLC GW 7.5 (CLC Bio). Последовательности картировали на геном человека (hg 19). Супернатант СЖ содержал клеточный детрит, сферические микрочастицы (20-40 нм) и везикулы, часть которых по размеру и морфологии соответствовала экзосомам. Препараты, полученные из СЖ путём ультрацентрифугирования и ультрафильтрации, содержали микрочастицы (17%), сферические и чашеобразные везикулы (40-100 нм, 83%), на поверхности которых иммуноцитохимически были выявлены специфические для экзосом маркеры (CD63, CD9 и CD24). Проведённое исследование показало, что в СЖ людей содержатся экзосомы в высокой концентрации, с которыми связаны РНК (размером менее 200 пар нуклеотидов) и геномная ДНК (размером 3-9 т.п.о.). Секвенирование ДНК показало, что около 92% прочтений (reads) картируются на геном человека.

Авторы:

Издание: Биомедицинская химия
Год издания: 2016
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2016.-N 1.-С.99-106. Библ. 27 назв.
Просмотров: 51