ПОЛУЧЕНИЕ БЛИЖНЕИНФРАКРАСНОГО ОДНОДОМЕННОГО ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО БЕЛКА GAF-FP НА ОСНОВЕ БАКТЕРИАЛЬНОГО ФИТОХРОМА

Аннотация:

Флуоресцентные белки (FP) широко применяются в качестве генетическикодируемых маркеров для количественного и неинвазивного исследования биологических процессов. Разработка биомаркеров, флуоресцирующих в ближнем инфракрасном спектральном диапазоне, позволяет изучать ткани животных на более глубоком уровне, поскольку они наиболее проницаемы для света этого диапазона длин волн, чем для света видимого диапазона. Для широкого применения FP важны такие свойства, как низкая молекулярная масса и мономерность. В настоящей работе на основе хромофоросвязывающего домена бактериального фитохрома (BphP) Rhodopseudomonas palustris (RpBphPl) нам удалось получить FP, названный GAF-FP, с мол. массой ~ 19 кДа, в 2 раза меньшей, чем у других FP на основе BphP, и в 1.4 раза меньше, чем у широко применяемых GFP-подобных белков, флуоресцирующих в ближнеинфракрасном диапазоне. В отличие от большинства других ближнеинфракрасных FP GAF-FP является мономером, обладает высокой фотостабильностью, его структура устойчива к внесению малых пептидных вставок. Более того, GAF-FP способен ковалентно присоединять два различных тетрапиррольных хромофора — фикоцианобилин (РСВ) и биливердин (BV), который содержится в тканях млекопитающих. GAF-FP с присоединенным BV в качестве хромофора (GAF-FP—BV) имеет основную полосу поглощения с максимумом при 635 нм. Максимум флуоресценции приходится на 670 нм, благодаря чему GAF-FP имеет высокое соотношение сигнала флуоресценции к фоновому сигналу, если даже FP локализован на глубине нескольких миллиметров под поверхностью ткани. Помимо ближнеинфракрасной полосы поглощения GAF-FP—BV имеет также полосу поглощения в фиолетовой области спектра с максимумом при 378 нм. Это свойство было использовано нами для создания химерного белка, состоящего из модифицированной люциферазы Renilla reniformis (RLuc8) и GAF-FP. Мы показали, что в созданном белке слияния возможен резонансный перенос энергии от субстрата, возбужденное состояние которого возникает при его окислении люциферазой, к хромофору GAF-FP—BV. В отсутствие акцептора энергии RLuc8 катализирует расщепление субстрата с излучением света с максимумом при 400 нм. В то же время в составе химерного белка GAF-FP—RLuc8 энергия от субстрата передается на хромофор FP и затем излучается в ближнем инфракрасном диапазоне, соответствующем спектру флуоресценции GAF-FP. Полученные результаты открывают путь для создания новых малых ближнеинфракрасных FP на основе различных природных BphP с перспективой их широкого применения в клеточной и молекулярной биологии.

Авторы:

Издание: Цитология
Год издания: 2016
Объем: 19с.
Дополнительная информация: 2016.-N 10.-С.744-762. Библ. 0 назв.
Просмотров: 28