РАСПРЕДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ, СОДЕРЖАЩИХ ПОЛИГЛУТАМИННУЮ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЬ, В КЛЕТКАХ ПУРКИНЬЕ МОЗЖЕЧКА ЧЕЛОВЕКА И КРЫСЫ

Аннотация:

В хромосомной ДНК достаточно часто встречаются повторяющиеся последовательности нуклеотидов, а в целом ряде белков в полипептидной цепочке наблюдается повторение одних и тех же аминокислотных остатков. Одним из наиболее частых нуклеотидных повторов в ДНК является последовательность ЦАГ (цитозин-аденин-гуанин), кодирующая аминокислоту глутамин. У человека выявлено свыше трех десятков белков с повтором более семи глутаминных остатков . При некоторых нейродегенеративных заболеваниях в ряде генов происходит экспансия нуклеотидных повторов ЦАГ и соответственно появление и накопление белков с увеличенным числом повторов остатков глутамина. Одним из таких «полиглутаминных» заболеваний является хорея Гентингтона, а большинство остальных — различные формы атаксий, связанных с дегенерацией клеток мозжечка . Полиглутаминные белки, связанные с нейродегенеративными заболеваниями, интенсивно изучаются, тогда как белки с повторами остатков глутамина, которые встречаются в норме, почти не исследовались. В настоящей работе была изучена локализация полиглутаминных белков в мозжечке человека и крысы — стандартного объекта, используемого при моделировании патологических состояний мозга. В работе были использованы фрагменты мозжечка человека (п = 4, возраст от 37 до 60 лет, мужчины, причина смерти которых не была связана с заболеваниями головного мозга) и половозрелых крыс-самцов Вистар (п = 4). Фрагменты мозжечка человека были получены из архива Отдела общей и частной морфологии Института экспериментальной медицины. Крысы содержались в виварии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН. Во всех экспериментах при эвтаназии животных соблюдали международные правила Хельсинкской декларации о гуманном обращении с животными и «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приказ № 755 МЗ СССР от 12.08.1977 г.). Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде и заливали в парафин. Из парафиновых блоков готовили срезы толщиной 5, 10 и 15 мкм и наклеивали на предметные стекла с адгезивным покрытием (Histobond и SuperF-rost Plus Gold, Германия). Для улучшения иммунореак-тивности выявляемых антигенов проводили их тепловое демаскирование в модифицированном цитратном буфере рН 6.1 (S1700, Dako, Дания). Контрольные им-муногистохимические реакции проводили с учетом рекомендаций производителей реагентов. При постановке иммуногистохимической реакции были использованы первичные моноклональные мышиные антитела (клон 1С2) к полиглутаминной последовательности (poly-Q) белков (Millipore, США) в разведении 1:1000—1:4000. Для выявления связанных с изучаемым маркером первичных антител использовали набор МАСН2-Universal HRP-Polymer (Biocare Medical, США). Для микроскопии в проходящем свете пе-роксидазную метку выявляли с использованием диа-минобензидинового хромогена (DAB+; Dako, Дания). Для конфокальной лазерной микроскопии перокси-дазную метку выявляли с помощью реакции с козьими антителами против HRP (horseradish peroxidase), конъюгированными с флуорохромом СуЗ (Jackson Im-munoResearch, США). Полученные препараты анализировали с помощью светового микроскопа DM750 (Германия), укомплектованного фотокамерой ICC50 (Leica, Германия) и конфокального лазерного микроскопа LSM 710 (Zeiss, Германия) с твердотельным лазером (561 нм). Анализ полученных изображений проводили при помощи компьютерных программ LAS EZ (Leica, Германия), Zen-2012 и LSM Image Browser (Zeiss, Германия). При изучении иммуногистохимических препаратов мозжечка человека и крысы обращает на себя внимание их высокое качество с четкой визуализацией выявляемых структур и отсутствием фона. Во всех случаях слабо окрашиваются ядра нервных и глиальных клеток. В препаратах коры мозжечка человека в клетках Пуркинье выявляется иммунопозитивная цитоплазматическая сеть сложной структуры.

Авторы:

Издание: Журнал эволюционной биохимии и физиологии
Год издания: 2017
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2017.-N 4.-С.302-307. Библ. 7 назв.
Просмотров: 36