ЭКСПРЕССИЯ В БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ, ОЧИСТКА И ХАРАКТЕРИСТИКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО бета2-АДРЕНОРЕЦЕПТОРА ДЛЯ МУЛЬТИАНАЛИТИЧЕСКОЙ ДЕТЕКЦИИ бета-АГОНИСТОВ

Аннотация:

Высокоэффективная экспрессия бета2-адренергического рецептора (бета2-AR) в функциональной форме необходима для разработки тест-системы, предназначенной для детектирования разнообразных нелегально употребляемых агонистов бета-адренорецепторов (бета-агонистов). Гетерологичная экспрессия этого мембранного белка в клетках связана с рядом трудностей, такими как низкий выход и неправильный фолдинг полипептида. Для преодоления этих затруднений мы поставили своей целью получить большое количество функционального бета2-AR в бесклеточной системе, основанной на экстрактах из Escherichia coli (Е. coli). Ген бета2-AR свиньи с оптимизированными кодонами (индекс адаптации кодонов, CAI = 0,96), адаптированный для экспрессии в Е. coli, был синтезирован и экспрессирован в бесклеточной системе, что позволило получить белок в высокой концентрации 1,1 мг/мл. После очистки методом Ni-аффинной хроматографии биологическая активность очищенного рецептора была определена с помощью нового рецепторного теста с использованием связанного энзима (ELRA). Было установлено, что сродство очищенного (бета2-AR к бета-агонистам убывало в ряду кленбутерол (CBL) > салбутамол (SAL) > рактопамин (RAC). При этом значения концентрации полумаксимального ингибирования (half maximal inhibitory concentration, IC50) составили 45,99, 60,8 и 78,02 мкг/л соответственно. Несмотря на то что активность полученного рецептора была немного ниже, чем у белка клеток насекомых и млекопитающих, разработанная система вполне позволяет получать бета2-AR, который может быть использован при скрининге различных соединений для выявления бета-агонистов.

Авторы:

Издание: Биохимия
Год издания: 2017
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2017.-N 11.-С.1709-1717. Библ. 29 назв.
Просмотров: 29