Полный текст
Л.П. Малежик, М.С. Малежик, Д.Ц. Нимаева, В.Б. Цырендоржиева
Агрегационная активность тромбоцитов у детей, часто болеющих респираторной вирусной инфекцией, при полиморфизме генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов
Читинская государственная медицинская академия, 672090, ул. Горького, 39а, тел. 8-(3022)-35-43-24, факс 8-(3022)-32-30-58, e-mail: pochta@chitgma.ru, г. Чита
Контактная информация: Л.П. Малежик, e-mail: rita.malezhik@mail.ru
Резюме:
В статье приведены данные об изменении аграгационной активности тромбоцитов у детей, часто болеющих острой респираторной вирусной инфекцией, при полиморфизме генов Тоll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов. Показано, что при полиморфизме Toll-4 (Asp299Gly) рецепторов спонтанная агрегационная активность у больных детей не изменена. АДФ, адреналин и коллаген увеличивают степень и скорость агрегации тромбоцитов при всех полиморфных вариантах гена Tоll-4 рецептора и уменьшают агрегационную активность тромбоцитов при полиморфизме Toll-6 рецептора, особенно у гетерозигот (Ser249Pro) и мутантных гомозигот (249Pro).
Ключевые слова:
острая респираторная вирусная инфекция, аграгация тромбоцитов, полиморфизм генов Toll-like рецепторов
L.P. Malezhik, M.S. Malezhik, D.Ts. Nimaena
Aggregational activity of thrombocytes in children with frequent respiratory viral infection and genes polymorfism Toll-4(Asp299Gly) and Toll-6 (Ser249Pro) receptors
Chita State Medical Academy, Chita
Summary:
The article presents data on the changes of aggregational platelet activity in children frequently suffering from acute respiratory viral infection with gene polymorphism Toll-4 (Asp299Gly) and Toll-6 (Ser249Pro) receptors. It has been shown that the Toll-4 polymorphism (Asp299Gly) receptors spontaneous aggregation activity in children is not changed. ADP, epinephrine and collagen increase the degree of platelet aggregation rate for all polymorphic variants of Toll-4 receptor gene and reduces platelet aggregation in polymorphism of Toll-6 receptor, particularly in heterozygotes (Ser249Pro) and mutant homozygotes (249Pro).
Key words:
acute respiratory viral infection, platelet aggregation, polymorphism of Toll-like receptor genes
Введение
Способность тромбоцитов образовывать агрегаты лежит в основе образования тромбоцитарной пробки, перекрывающей кровоток в мелких сосудах. В норме тромбоциты свободно циркулируют в кровотоке, не контактируя друг с другом. При любой патологии в кровотоке появляются биологически активные вещества, которые активируя тромбоциты, вызывают экспрессию на поверхности кровяных пластинок рецепторов, лигандами для которых являются фибриноген, коллаген, фибронектин, фактор Виллебранда и ряд других соединений [1, 2, 3]. Тромбоциты при этом адгезируют, образуют тромбоцитарные агрегаты с выделением огромного количества белков, принимающих участие в процессах гемостаза, воспаления, иммунной защиты, ангиогенезе и т.д. [3, 4, 5].
При вирусной инфекции появляется множество причин для активации тромбоцитов, и, в первую очередь, нейраминидаза вируса, к которой есть рецепторы на поверхности тромбоцитов [6]. Циркуляция в крови больших количеств тромбоцитарных агрегатов способна вызвать ухудшение серологических свойств и, соответственно, расстройство микроциркуляции [7].Однако агрегационная активность тромбоцитов при острой респираторной вирусной инфекции (ОРВИ) не изучалась, и тем более неизвестно, насколько она изменяется при генетических дефектах в Toll-рецепторах. С помощью этих рецепторов тромбоциты контактируют с патогенами, активируются и секретируют собственные соединения.
Цель исследования - изучить спонтанную и индуцированную агрегацию у детей, часто болеющих ОРВИ и являющихся носителями полиморфизма генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов.
Материалы и методы
Отбор для клинической группы осуществляли на базе областной детской инфекционной больницы в первые трое суток от момента госпитализации (период начальных проявлений заболевания). Обследовано 190 детей обоего пола от 1 до 3 лет, часто болеющих ОРВИ. Из числа обследуемых детей методом ПЦР у 49 % был диагностирован грипп, у 25 % - парагрипп, у 5 % - аденовирусная инфекция, у 4 % - ресираторно-синцитиальный вирус. У остальных детей этиология ОРВИ осталась нерасшифрованной. Критериями включения в исследование являлось число эпизодов заболевания не менее 6 раз в году, первые три дня заболевания вирусной инфекцией, наличие характерной клинической картины (лихорадка, интоксикация, выраженные катаральные явления). В исследование не включали детей с хроническими бронхолёгочными заболеваниями (бронхиальная астма, рецидивирующий бронхит), пороками развития или опухолями дыхательной системы. В контрольную группу вошли 25 клинически здоровых детей (не более 4 эпизодов ОРВИ в году), сопоставимые по возрасту и полу с часто болеющими.
Из обследованных часто болеющих детей 90 являлись носителями полиморфизма генов Toll-4 (Asp299Gly) рецепторов, 100 больных обладали полиморфизмом Toll-6 (Ser 249Pro) рецепторов. Выделение ДНК осуществляли при помощи наборов "ДНК-экспресс кровь" (НПФ "Литех, Россия). Синтез использованных в работе олигонуклеотидных праймеров выполнен НПФ "Литех". Выявление мутаций проводили методом ПЦР с электрофоретической детекцией продуктов амплификации.
Оценку агрегационной способности тромбоцитов осуществляли турбидиметрическим методом с помощью лазерного анализатора агрегации "Биола" (НПФ "Биола", Москва). Исследовали спонтанную АДФ, адреналин- и коллаген-индуцированную агрегацию с использованием соответствующих реактивов, выпускаемых ООО "Технология-стандарт" (Барнаул).
Полученные данные обработаны методом вариационной статистики для связанных между собой наблюдений с помощью пакета статистических программ Microsoft Eхcel 2007, STATISTICA 6,0 (StatSoftInc., США). Перед началом анализа вариационные ряды тестировали на нормальность с использованием критерия Шапиро-Уилка. При нормальном распределении применяли параметрические методы статистики - критерий Стъюдента (t-тест). Показатели представлены в виде средних величин со стандартным отклонением (М±SD).
Результаты и обсуждение
Установлено, что у больных с генетическими дефектами в Toll-4 рецепторах спонтанная агрегация не изменена (табл. 1). АДФ-индуцированная агрегация вызывает увеличение скорости и степени агрегации в зависимости от наличия или отсутствия генетических дефектов в Toll-4 рецепторах. Размер образованных агрегатов увеличивался у гомозигот Asp 299 до 5,8±2,3, у гомозигот 299Gly - до 7,8±2,6. Следовательно, при аномальных вариантах Toll-4 рецепторов АДФ индуцирует скорость и степень агрегации сильнее, чем у носителей нормальной аллели Asp299. Возможно, у тромбоцитов с генетическими дефектами в Toll-4 рецепторах увеличена экспрессия рецепторов к индукторам агрегации, к числу которых относится АДФ.
Таблица 1. Максимальный радиус агрегатов (отн. ед.) и максимальный наклон (отн. ед. в мин.) кривых агрегации ромбоцитов у пациентов носителей полиморфных вариантов Asp299Gly в гене Toll-4 рецепторов (M±SD) Показатели Контрольная группа (n=25) 299Asp (n=40) Asp299Gly (n=18) 299Gly (n=32)
Спонтанная макс. знач. 1,9±0,6 1,9±1,2 1,2±0,2 1,3±0,4
макс. накл. 1,3±0,6 1,4±2,5 1,2±0,1 1,6±0,5* p<0,05
АДФ макс. знач. 3,5±0,7 5,8±1,3* p<0,05 9,8±1,7*# p<0,05 p*<0,05 7,8±1,2*# p<0,05 p*<0,05
макс. накл. 3,8±0,6 11,3±2,4* p<0,05 25,8±4,3*# p<0,05 p*<0,05 24,2±2,4* p<0,05
Адреналин макс. знач. 3,7±0,8 6,1±1,7* p<0,05 8,2±2*# p<0,05 p*<0,05 6,8±3* p<0,05
макс. накл. 3,4±0,9 7,2±4* p<0,05 17,6±2,5*# p<0,05 p*<0,05 14,5±2,2*# p<0,05 p*<0,05
Коллаген макс. знач. 4±0,9 6,6±0,9* p<0,05 7,8±2,2*# p<0,05 p*<0,05 7,3±1,5*# p<0,05 p*<0,05
макс. накл. 3,9±0,9 14,3±1,5 12,6±2,6* p<0,05 18,3±1,6*# p<0,05 p*<0,05
Примечание. *p<0,05 - различия достоверны по сравнению с контролем; #p<0,05 - различия достоверны по сравнению с гомозиготами 299Asp.
При индукции адреналином степень агрегации тромбоцитов с генетически изменёнными Toll-4 рецепторами была максимальна у гетерозигот Asp 299Gly (8,2±2). Скорость агрегации у гомозигот 299Asp была увеличена в 2 раза (7,2±4) по сравнению с тромбоцитами здоровых детей (3,4±0,9), в 5 раз - у гетерозигот (17,6±5,5) и в 4 раза у гомозигот 299Gly. При стимуляции коллагеном тромбоциты больных ОРВИ детей без генетических дефектов в Toll-4 рецепторах (299Asp) увеличивали максимальный радиус агрегатов до 6,6±0,9 (в контроле -4,0±0,9). При аномалии в этих рецепторах степень агрегации оказалась выше (7,8±2,2; 7,3±1,5), чем в группе детей без генетических нарушений в тромбоцитарных рецепторах.
Полиморфные варианты гена Toll-4 рецептора отличались и по скорости индуцированной агрегации. Коллаген увеличивал скорость агрегации в крови здоровых детей с 1,3±0,6 до 3,9±0,9. Тромбоциты больных детей агрегировали значительно быстрее. В группе детей- носителей нормальной аллели Asp/Asp агрегация увеличивалась с 1,49±2,5 до 14,3±7,5; у гетерозигот Asp299Gly - до 18,3±5,6.
Тромбоциты с аномальными Toll-6 рецепторами (табл. 2) отвечали на индукцию АДФ уменьшением скорости агрегации. Особенно низка была скорость агрегации у гомозигот 249Pro (7,1±6,0). При этом максимальный размер образованных агрегатов уменьшался у гетерозигот Ser249Pro (6,4±1,2) гомозигот 249Pro (7,6±2,7) по сравнению с гомозиготами 249Ser (9,7±1,9). При индукции адреналином и коллагеном тромбоциты с полиморфизмом гена Toll-6 рецептора отвечали снижением скорости и степени агрегации.
Таблица 2. Максимальный радиус агрегатов (отн. ед.) и максимальный наклон (отн. ед. в мин.) кривых агрегации тромбоцитов у пациентов носителей полиморфных вариантов Ser249Pro в гене Toll-6 рецепторов (M±SD) Показатели Контрольная группа (n=25) 249Ser (n=25) Ser249Pro (n=50) 249Pro (n=25)
Спонтанная макс. знач. 1,9±0,6 1,4±0,4 1,3±0,5 1,3±0,1
макс. накл. 1,1±1,1 1,3±0,2* p<0,05 1,4±0,1* p<0,05 1,5±0,4
АДФ макс. знач. 3,5±0,7 9,7±1,9* p<0,05 6,4±1,2*# p<0,05 p*<0,05 7,6±2,7* p<0,05
макс. накл. 3,8±0,6 30,2±3,3* p<0,05 16,2±1,8*# p<0,05 p*<0,05 7,1±6*# p<0,05 p*<0,05
Адреналин макс. знач. 3,7±0,8 6,9±1,5* p<0,05 5,3±1,3*# p<0,05 p*<0,05 4,9±1,6*# p<0,05 p*<0,05
макс. накл. 3,4±0,9 12,3±2,8* p<0,05 7,4±1,7*# p<0,05 p*<0,05 4,3±1,2*# p<0,05 p*<0,05
Коллаген макс. знач. 4±0,9 8,2±1,4* p<0,05 6,4±0,8*# p<0,05 p*<0,05 7,5±1,5*# p<0,05 p*<0,05
макс. накл. 3,9±0,9 22,9±2,3* p<0,05 17,3±2*# p<0,05 p*<0,05 9,9±1,3*# p<0,05 p*<0,05
Примечание. *p<0,05 - различия достоверны по сравнению с контролем; #p<0,05 - различия достоверны по сравнению с гомозиготами 299Asp.
Резюмируя сказанное, следует отметить, что генетические дефекты в Toll-4 и Toll-6 рецепторах по-разному отражались на индуцированной агрегации. При изменениях в гене, кодирующих Toll-4 рецепторы, индукция АДФ, адреналином и коллагеном увеличивали способность тромбоцитов к агрегации. При генетических изъянах в Toll-6 рецепторах индукция теми же агонистами уменьшали агрегационные свойства кровяных пластинок. Мы считаем, что эффекты индуцированной агрегации связаны с количеством экспрессированных к ним рецепторов и путей трансмембранной сигнализации. Согласно данным литературы, различные сигнальные рецепторы имеют свои пути внутриклеточной активации, которые опосредуются через последовательное подключение адапторных белков, протеинкиназ и транскрипционных факторов [8, 9, 10]. В итоге экспрессируется разное количество генов, кодирующих рецепторы к различным биологически активным веществам. Если это так, то реакция генетически аномальных Toll-4 рецепторов сопровождается увеличением экспрессии рецепторов к АДФ, адреналину, коллагену. При полиморфизме генов Toll-6 рецепторов, напротив число экспрессируемых рецепторов агрегации уменьшается.
Выводы
1.При полиморфизме генов Toll-4 (Asp299Gly) и Toll-6 (Ser249Pro) рецепторов диаметрально изменяются агрегационные свойства тромбоцитов.
2.Уровень агрегационной активности тромбоцитов, по всей вероятности, определяется экспрессией тромбоцитарных рецепторов и внутриклеточными путями активации тромбоцитов
Литература
1. Баркаган З.С. Гемостаз. В кн: Руководство по гематологии под ред. А.И. Воробьёва. - М.: Ньюдиамед, 2005. -С. 9-147.
2. Бельченко Д.И., Есипова А.В., Кривошеина Е.Л. Активация межклеточных взаимодействий в циркулирующей крови и микроциркуляции // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2005. - № 4 (16). - С. 53-57.
3. Березовская Г.А. Апоптоз тромбоцитов: причины недостаточной эффективности антитромбоцитарных препаратов // Бюллетень СО РАМН. - 2011. - Т. 32, № 4. - С. 17-27.
4. Бурячковская Л.И. Гетерогенность тромбоцитов человека и животных. Связь морфологических особенностей с функциональным состоянием: автореф. … дис. д-а биол. наук. - М., 2007. - 46 с.
5. Козлов И.Г. Сигнальные рецепторы врождённого иммунитета: новая молекулярная мишень для диагностики и терапии воспалительных заболеваний // Вестник РАМН. - 2011. - № 1. - С. 42-50.
6. Кузник Б.И. Клеточные и молекулярные механизмы регуляции системы гемостаза в норме и патологии. - Чита: Экспресс-издательство, 2010. - 832 с.
7. Соколов Е.И., Бурячковская Л.И., Зыкова А.А., Голобородова И.В. Динамика морфологических структур тромбоцитов у больных ишемической болезнью сердца в зависимости от уровня жирных кислот в крови // Кардиология. - 2011. - № 1. - С. 29.
8. Шитикова А.С. Тромбоцитопатии врождённые и приобретённые. - СПб., 2008. - 381 с.
9. Andonegyi G., Kenfoot S.M., McNagny K., et al. Platelets eхpress functional Toll-like receptor 4 // Blood. - 2005. - Vol. 106. - P. 21417-21423.
10. Caamano G., Hunger C. A. NF-kb family of tranckiption factors central regulators of innate and adaptive immune functions // Сunction // Сlin. Mikrobiol. Rev. - 2002. -Vol. 15, № 3. - P. 414-429.
11. JamamotoU., Sato S., Hemmi H., et al. Role of adaptor TRIF in the MyD88-independent Toll-like receptor signaling pathway // Sience. - Vol. 301. - P. 640-643.
Цель исследования - изучить спонтанную и индуцированную агрегацию у детей, часто болеющих ОРВИ и являющихся носителями полиморфизма генов Toll-4 и Toll-6 рецепторов.В статье приведены данные об изменении аграгационной активности тромбоцитов у детей, часто болеющих острой респираторной вирусной инфекцией, при полиморфизме генов Тоll-4(Asp299Gly) и Toll-6(Ser249Pro) рецепторов. Показано, что при полиморфизме Toll-4 (Asp299Gly) рецепторов спонтанная агрегационная активность у больных детей не изменена. АДФ, адреналин и коллаген увеличивают степень и скорость агрегации тромбоцитов при всех полиморфных вариантах гена Tоll-4 рецептора и уменьшают агрегационную активность тромбоцитов при полиморфизме Toll-6 рецептора, особенно у гетерозигот (Ser249Pro) и мутантных гомозигот (249Pro).
Добавить в коллекцию