Полный текст
М.А. Власова1, О.В. Островская1, Н.М. Ивахнишина1, Н.Ф. Иевлева2, Н.Е. Пермина2, Н.Г. Сидорчук1
Диагностика бактериального вагиноза у женщин с цервицитами методом ПЦР в реальном времени
1Хабаровский филиал ДНЦ ФПД - Научно-исследовательский институт охраны материнства и детства, 680022, ул. Воронежская, 49, корп. 1, тел. 8-(4212)-98-05-91, e-mail: iomid@yandex.ru;
2НУЗ "Дорожная клиническая больница на ст. Хабаровск-1 ОАО "РЖД" 680022, ул. Воронежская, 49, тел. 8-(4212)-40-93-93, e-mail: @dkb-dv.ru, г. Хабаровск
Контактная информация: О.В. Островская, e-mail: olrom41@mail.ru
Резюме:
Целью работы было определение частоты встречаемости вагиноза влагалища у женщин с хроническими рецидивирующими цервицитами. Данное исследование выполнено с применением ПЦР в реальном времени (тест "Фемофлор-16"), Проведено исследование соскобов клеток заднебокового свода влагалища у длительно болеющих женщин с цервицитами без эктопии шейки матки (1-я группа, n=100), пациенток с цервицитами и эктопией шейки матки (2-я группа, n=31), а также у условно здоровых женщин, планирующих беременность (3-я группа, n=35). Дисбиоз влагалища обнаружен соответственно в 37,0 %, в 32,2 %, в 11,1 % случаев. Структуру дисбиоза представляли преимущественно облигатные анаэробные возбудители. Аэробный и смешанный дисбиоз установлены только в группе женщин с цервицитами без эктопии. Рекомендуется применять ПЦР-РВ для оценки микроценоза влагалища у женщин с затяжными и рецидивирующими цервицитами и на предгравидарном этапе для своевременного и адекватного лечения.
Ключевые слова:
дисбиоз влагалища, цервициты, эктопия шейки матки, ПЦР в реальном времени
М.А. Vlasova1, О.V. Ostrovskaya1, N.М. Ivakhnishina1, N.F. Ievleva2, N.Е. Permina2, N.G. Sidorchuk1
Bacterial vaginosis diagnostics in women with cervicitis by real-time PCR method
1Research Institute of Mother and Child Health Care - Khabarovsk Branch of the Far-Eastern Research Center of Respiratory Physiology and Pathology;
2Railway Hospital at Khabarovsk-1 Railway Station of Russian Railways, Khabarovsk
Summary:
Assessment of vaginosis prevalence in women with long-term cervicitis. Scrapings of posterolateral vaginal fornix in women with long-term cervicitis in the absence of cervical ectropion (1st group, n=100), women with long-term cervicitis and cervical ectropion (2nd group, n=31), and relatively healthy women preparing for pregnancy (n=35) were examined using Femoflor-16 test (PCR-RT). Vaginal dysbiosis was found in 37,0 %, 32,2 %, and 11,1 % of cases, respectively. Dysbiosis structure was represented primarily by obligate anaerobes. Aerobic and mixed dysbiosis were only found in women with cervicitis in the absence of cervical ectropion. Real-time PCR method is recommended for assessment of microcenosis in women with long-term and recurrent cervicitis and in women preparing for pregnancy in order to provide early adequate therapy.
Key words:
vaginal dysbiosis, vaginitis, cervicitis, cervical ectropion, real-time PCR
Введение
Бактериальный вагиноз - малосимптомный патологический процесс, развивающийся в результате воздействия различных эндо- и экзогенных факторов, сопровождающийся дисбалансом микроэкосистемы влагалища, резким снижением содержания или отсутствием молочно-кислых бактерий и чрезмерно высокой концентрацией условно-патогенных микроорганизмов, что может приводить к повышению влагалищного pH, появлению выделений из влагалища, сопровождающихся запахом. Клиническое значение диагностики дисбиоза связано с тем, что часть дисбиотических процессов могут протекать бессимптомно или со слабо выраженной симптоматикой с переходом в хронически рецидивирующие формы и распространение на верхние отделы урогенитального тракта. Бактериальный вагиноз увеличивает восприимчивость к инфекциям, передающимся половым путем, повышает риск инфекционных осложнений после абортов и гинекологических операций, риск развития воспалительных заболеваний органов малого таза, невынашивания беременности, преждевременных родов [2, 5, 9].
На сегодняшний день в достаточной степени изучена микробиология бактериального вагиноза, определен спектр ассоциированных с ним микроорганизмов. В первую очередь, это Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae а также бактерии родов Prevotella, Mobiluncus, Bacteroides, Fusobacterium, Corynebacterium, Leptotrichia и др. [1, 2, 3]. Из всех анаэробов только гарднереллу можно обнаружить микроскопически по наличию "ключевых клеток". Остальные облигатные анаэробы выявляются бактериологически, это длительно, дорого и трудоемко, требует применения анаэробной микробиологической техники.
Условно патогенные микроорганизмы могут присутствовать как при патологических состояниях (в значительных количествах), так и в норме (в ограниченном количестве). Разработка и применение в лабораторной диагностике метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) позволило проводить многофакторный качественный и количественный анализ условно патогенной микрофлоры генитального тракта. Использование этого метода повышает информативность диагностики бактериального вагиноза, сокращает время, стоимость и трудоемкость исследования по сравнению с классическими методами, позволяет выявлять широкий спектр микроорганизмов, в том числе трудно культивируемых [8, 10].
Цель работы: определить частоту встречаемости бактериального вагиноза влагалища у женщин с длительными, плохо поддающимися лечению цервицитами, используя метод ПЦР-РВ, тест "Фемофлор-16".
Материалы и методы
Проведено исследование соскобов клеток заднебокового свода влагалища у женщин, страдающих длительными воспалительными процессами шейки матки. В 1-ю группу исследованных вошли женщины с цервицитами без эктопии (n=100), во 2-ю - пациентки с цервицитами и эктопией шейки матки (n=31), 3-ю группу составили условно здоровые женщины, готовящиеся к беременности и не предъявляющие жалоб (n=35). При предварительном обследовании во всех группах не было выявлено безусловных патогенов таких, как Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorrhoeae, Trichomonas vaginalis, Мycoplasma genitalium.
Состояние биоценоза влагалища определяли методом ПЦР-РВ с использованием реагентов "Фемофлор-16" в детектирующем амплификаторе ДТ-96 (НПО ДНК - Технология, Россия). Данный набор включает комплекс реагентов для выявления контроля взятия материала, количественного определения общей бактериальной массы (ОБМ), количественной оценки нормофлоры (Lactobaccilus spp.) и 23 наиболее клинически значимых условно-патогенных микроорганизмов c выяснением соотношений между ними и ОБМ.
Для получения адекватных результатов использовали только образцы с достаточным количеством клеток цервикального канала, попавших в пробирку с анализируемой пробой и достаточной ОБМ. Учитывали пробы, в которых количество ДНК клеток человека было больше 10 4 геном - эквивалентов (ГЭ) в образце, а величина ОБМ составляла от 106 до 109 ГЭ в образце. С помощью программного обеспечения устанавливалось количество ОБМ, лактобацилл и различных групп условно-патогенных микроорганизмов количественным методом и относительно ОБМ. Количественную оценку влагалищной микрофлоры проводили как в абсолютных, так и в относительных показателях. Абсолютный показатель - количество ДНК искомого микроорганизма в образце, выраженное в ГЭ, представленное в виде десятичного логарифма - lg. Относительный количественный показатель микроорганизма рассчитывали как отношение количества искомого микроорганизма к количеству ОБМ. Количественный показатель был представлен в двух форматах: разница десятичных логарифмов количества соответствующей группы микроорганизмов и ОБМ и в процентах по отношению ОБМ.
Результаты рассматривали в соответствии с критериями, разработанными Г.Т. Сухих и соавтор. (2011) [8]. Классификация видов биоценоза включала:
1) нормоценоз абсолютный - вариант биоценоза, при котором доля нормофлоры составляет 80 до 100 % = относительно ОБМ, количество Ureaplasma spp., Mycoplasma spp. - менее 104 гэ/мл; а грибов рода Candida - менее 103 гэ/мл;
2) нормоценоз условный - доля нормофлоры составляет 80-100 % относительно ОБМ, количество Ureaplasma spp., Mycoplasma spp. - более 104 гэ/мл, а Candida spp. - более 103 гэ/мл;
3) дисбаланс умеренный (аэробный, анаэробный или смешанный) - доля лактобактерий снижена до 20-80 % относительно ОБМ за счет увеличения количества анаэробов и/или аэробов;
4)) дисбаланс выраженный (аэробный, анаэробный или смешанный) - доля лактобактерий снижается до 20 % и менее, доля условно патогенных микроорганизмов достигает 80-100 % относительно ОБМ.
Полученные результаты обработаны с помощью программы Statistika for Windows 6,0 (Statsoft Inc., США). Различия между группами считали достоверными при p<0,05.
Результаты и обсуждение
Анализ полученных данных показал, что нормоцетоз, в частности абсолютный нормоцетоз, в 1-й и 2-й группах определяли в 1,4-1,3 раза реже, чем в 3-й группе женщин (p<0,0020, p<0,0181, табл. 1).
Дисбиотическое состояние влагалища в 1-й и 2-й группах (37,0 % и 32,2 %) определили в 3,3 и 2,8 раза чаще, чем в 3-й группе (11,4 %, p<0,0020, p<0,0181). Не было выявлено статистических различий между частотой выявления нормоцитоза и дисбиоза влагалища в 1-й и 2-й группах. Этиология цервицитов ассоциируется с такими патогенами как стафилококки, стрептококки, кишечная палочка, возбудители хламидиоза, уреаплазмоза, гонококковой, трихомонадной, герпетической инфекции с соответствующей клинической картиной. Но наши данные показывают, что у каждой 3-й женщины с цервицитами определяется дисбиоз влагалища. Нелеченный дисбиоз усугубляет течение воспалительных процессов, способствует длительному течению и рецидивам. У большинства обследованных женщин был определен анаэробный дисбиоз с наличием облигатно-анаэробных микроорганизмов: в 1-й группе - в 86,5 % случаев, во 2-й и 3-й группах - в 100 %. Выраженный дисбиоз в 7,2 и 5,5 раз чаще выявляли в 1-й и 2-й группах по сравнению с 3-й (p<0,0066 и p<0,0335). Умеренный смешанный дисбиоз (сочетание аэробных и анаэробных микроорганизмов) диагностировали только у 2 пациенток 1-й группы женщин (в одном случае - Streptococcus spp. и Candida spp; в другом - Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp. и Enterobacteriaceae). Выраженный аэробный дисбиоз, связанный со Streptococcus spp., определен тоже только у женщин 1-й группы (всего 5 случаев). Обращает на себя внимание тот факт, что у женщин, готовящихся к беременности и не предъявляющих жалоб, дисбиоз установлен в 11,4 % случаев. Структуру его составили: Gardnerella vaginalis/Prevotella bivia/Porphyromonas spp., Eubacterium sp. и Ureaplasma (urealyticum + parvum). Существуют данные, указывающие на причинно-следственные связи между развитием микробного дисбаланса в вагинальном биотопе и увеличением риска развития преждевременных родов [1, 2, 3].
Таблица 1. Распознавание дисбиоза влагалища у женщин с цервицитами шейки матки (абс./%) Состояние биоценоза Цервициты без эктопии шейки матки (n=100) Цервициты с эктопией шейки матки (n=31) Условно здоровые женщины, планирующие беременность (n=35) Достоверность различий, p*
1-я группа 2-я группа 3-я группа 1 и 3 2 и 3 1 и 2
Нормоценоз 63/63,0 21/67,8 31/88,6 0,0020 0,0181 0,3060
- абсолютный 35/35,0 11/35,4 19/54,4 0,0241 0,0241 0,4534
- условный 28/28,0 10/32,3 12/34,2 0,2516 0,4316 0,3339
Дисбиоз 37/37,0 10/32,2 4/11,4 0,0020 0,0181 0,3060
умеренный 16/16,0 5/16,1 3/8,6 0,1535 0,1535 0,4475
- анаэробный 14/14,0 5/16,1 3/8,6 0,2223 0,1535 0,3911
- смешанный 2/2,0 0 0 0,1996 0,5000 0,2137
выраженный 21/21,0 5/16,1 1/2,9 0,0066 0,0335 0,2709
- анаэробный 16/16,0 5/16,1 1/2,9 0,0231 0,0335 0,4475
- аэробный 5/5,0 0 0 0,0888 0,5000 0,1021
Примечание. * - значение p<0,05 выделено жирным шрифтом.
Этиологическая структура дисбиоза показана в таблице 2. В 1-й группе наиболее часто определяли сочетание Gardnerella vaginalis /Prevotella bivia/Porphyromonas spp., а также Eubacterium spp и Ureaplasma (urealyticum + parvum). Известно, что такой микроорганизм, как G.vaginalis передается половым путем, вызывает вагиноз влагалища, при этом меняется pH влагалища, уменьшается количество лактобактерий, появляются водянистые выделения и резкий рыбный запах. Далее в ассоциации с другими условно-патогенными возбудителями G. vaginalis вызывает неспецифические вагиниты, цервициты.
Таблица 2. Частота выявления микроорганизмов в генитальном тракте женщин в сравниваемых группах (%) Микроорганизмы Группы обследуемых женщин
первициты без эктопии шейки матки (n=100). Группа № 1 цервициты с эктопией шейки матки (n=31). Группа № 2 планирование беременности (n=35). Группа № 3
Факультативно-анаэробные Enterobacteriaceae 1,0 0 0
Streptococcus spp. 6,0 0 0
Staphylococcus spp. 0 0 0
Облигатно-анаэробные Gardnerella vaginalis /Prevotella bivia/Porphyromonas spp. 18,0 19,3 8,6
Eubacterium spp 12,0 22,5 8,6
Sneathia spp./Leptotrihia spp./Fusobakterium spp. 5,0 10,0 0
Megasphaera spp./Veillonella spp./Dialister spp. 2,0 3,2 0
Lachnobacterium spp./Clastridium spp. 3,0 0 0
Atopobium vaginae 6,0 22,5 0
Дрожжеподобные грибы Candida spp. 5,0 3,2 0
Микоплазмы Mycoplasma hominis 2,0 10,0 0
Ureaplasma (urealyticum + parvum) 8,0 19,3 8,6
Состав микроценоза влагалища отличался у женщин 1-й и 2-й групп. У женщин с цервицитами и эктопией шейки матки в 3,8 раз чаще выявляли Atopobium vaginae (p<0,0029) , в 5 раз чаще M. hominis (p<0,0221), в 2,4 раза чаще Ureaplasma (p<0,0411). Atopobium vaginae - высокоспецифичный маркер бактериального вагиноза, устойчивый к лечению метронидозолом, ассоциированный с длительным рецидивирующим течением заболевания [6, 7].
Микоплазмы и дрожжевые грибы обнаруживали преимущественно в сочетании с облигатными анаэробными микроорганизмами.
Выводы
1.Дисбиоз влагалища установлен у женщин с хроническими рецидивирующими цервицитами с наличием или без эктопии шейки матки в 30,0-32,2 % случаев, в группе условно здоровых женщин, готовящихся к беременности - в 11,1 %. Структуру дисбиоза представляли преимущественно облигатные анаэробные возбудители: Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Eubacterium spp. и другие. Дисбиотическое состояние влагалаща способствует хронизации воспалительного процесса в шейке матки.
2.Структура дисбиоза у пациенток с цервицитом и наличием эктопии шейки матки отличалась от этого показателя у женщин с цервицитами и без эктопии, достоверно чаще у женщин с эктопией определяли Atopobium vaginae, Ureaplasma, M. hominis. Считается, что A. vaginae - маркер длительного рецидивирующего течения заболевания, устойчивости к лечению метронидазолом, маркер, который можно рассматривать как ко- фактор или как триггер заболевания.
3.Факт установления дисбиоза влагалища у 11,1 % женщин, готовящихся к беременности и не высказывающих жалоб, заслуживает особого внимания. Ранее доказанная связь дисбиотических процессов с репродуктивными патологиями [1, 2, 3] диктует целесообразность лабораторной диагностики дисбиоза влагалища женщинам и в период прегравидарной подготовки и на ранних сроках беременности методом ПЦР-РВ с селективной деконтаминацией и последующим восстановлением нормальной микрофлоры.
4.Оценка микробиоты влагалища при воспалительных процессах в шейке матки с помощью метода ПЦР-РВ улучшает качество диагностики, позволяет выработать индивидуальный подход при назначении лекарственной терапии, способствующей сохранению здоровья женщины. Успех терапии будет зависеть как от элиминации возбудителей, так и от восстановления нормоценоза.
Литература
1. Бондаренко К.Р., Озолиня Л.А, Бондаренко В.М., Шпирко В.О. Особенности влагалищной микроэкосистемы в период гестации (обзор литературы) // Вестник РГМУ. - 2014. - № 4. - С. 6-11.
2. Власова М.А., Островская О.В., Супрун С.В., Кондрашова Е.А., Ивахнишина Н.М., Наговицына Е.Б. Применение теста "Фемофлор-16" для оценки состояния биоценоза генитального тракта у женщин с преждевременными родами // Дальневосточный медицинский журнал. - 2016. - № 3. - С. 54-57.
3. Гродницкая Е.Э. Микробиоценоз влагалища и пути его коррекции у женщин с самопроизвольным прерыванием беременности в поздние сроки гестации в анамнезе // Российский вестник акушера-гинеколога. - 2011. - № 1. - С. 22-25.
4. Калинкина О.Б. Эффективность восстановления биоценоза влагалища женщин с синдромом поликистозных яичников при лечении псевдоэрозии шейки матки // Профилактика рака шейки матки: взгляд в будущее. - Сборник трудов международной научно-практической конференции. - М., 2008. - С. 62-63.
5. Кудрявцева Л.В. Бактериальный вагиноз. Пособие для врачей. - М., 2003. - 55 с.
6. Плахова К.И. Роль Atopobium vaginae при рецидивировании бактериального вагиноза // Вестник дерматологии и венерологии. - 2007. - № 5. - С. 10-13.
7. Рахматулина М.Р., Плахова К.И. Бактериальный вагиноз, ассоциированный с Atopobium vaginae: современные принципы диагностики и терапии // Акушерство и гинекология. - 2012. - № 3. - С. 88-92.
8. Применение метода полимеразной цепной реакции в реальном времени для оценки микробиоценоза урогенитального тракта у женщин (тест Фемофлор) (медицинская технология) / Г.Т. Сухих [ и др. ]. - М., 2011. - 36 с.
9. Тихомиров А.Л. Бактериальный вагиноз. Всегда ли и только антибиотики? // Consilium medicum. - 2011. - № 13 (6). - С. 52-55.
10. Шипицына Е.В. Применение теста фемофлор для оценки микробиоценоза влагалища // Журнал акушерства и женских болезней. - СПб., 2012. - LXI, № 2. - С. 57-64.
Бактериальный вагиноз - малосимптомный патологический процесс, развивающийся в результате воздействия различных эндо- и экзогенных факторов, сопровождающийся дисбалансом микроэкосистемы влагалища, резким снижением содержания или отсутствием молочно-кислых бактерий и чрезмерно высокой концентрацией условно-патогенных микроорганизмов, что может приводить к повышению влагалищного pH, появлению выделений из влагалища, сопровождающихся запахом. Клиническое значение диагностики дисбиоза связано с тем, что часть дисбиотических процессов могут протекать бессимптомно или со слабо выраженной симптоматикой с переходом в хронически рецидивирующие формы и распространение на верхние отделы урогенитального тракта. Бактериальный вагиноз увеличивает восприимчивость к инфекциям, передающимся половым путем, повышает риск инфекционных осложнений после абортов и гинекологических операций, риск развития воспалительных заболеваний органов малого таза, невынашивания беременности, преждевременных родов . На сегодняшний день в достаточной степени изучена микробиология бактериального вагиноза, определен спектр ассоциированных с ним микроорганизмов. В первую очередь, это Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae а также бактерии родов Prevotella, Mobiluncus, Bacteroides, Fusobacterium, Corynebacterium, Leptotrichia и др. Из всех анаэробов только гарднереллу можно обнаружить микроскопически по наличию "ключевых клеток". Остальные облигатные анаэробы выявляются бактериологически, это длительно, дорого и трудоемко, требует применения анаэробной микробиологической техники. Условно патогенные микроорганизмы могут присутствовать как при патологических состояниях (в значительных количествах), так и в норме (в ограниченном количестве). Разработка и применение в лабораторной диагностике метода ПЦР с детекцией результатов в режиме реального времени (ПЦР-РВ) позволило проводить многофакторный качественный и количественный анализ условно патогенной микрофлоры генитального тракта. Использование этого метода повышает информативность диагностики бактериального вагиноза, сокращает время, стоимость и трудоемкость исследования по сравнению с классическими методами, позволяет выявлять широкий спектр микроорганизмов, в том числе трудно культивируемых .Целью работы было определение частоты встречаемости вагиноза влагалища у женщин с хроническими рецидивирующими цервицитами. Данное исследование выполнено с применением ПЦР в реальном времени (тест "Фемофлор-16"), Проведено исследование соскобов клеток заднебокового свода влагалища у длительно болеющих женщин с цервицитами без эктопии шейки матки (1-я группа, n=100), пациенток с цервицитами и эктопией шейки матки (2-я группа, n=31), а также у условно здоровых женщин, планирующих беременность (3-я группа, n=35). Дисбиоз влагалища обнаружен соответственно в 37,0 %, в 32,2 %, в 11,1 % случаев. Структуру дисбиоза представляли преимущественно облигатные анаэробные возбудители. Аэробный и смешанный дисбиоз установлены только в группе женщин с цервицитами без эктопии. Рекомендуется применять ПЦР-РВ для оценки микроценоза влагалища у женщин с затяжными и рецидивирующими цервицитами и на предгравидарном этапе для своевременного и адекватного лечения.
Добавить в коллекцию