ОСОБЕННОСТИ РАЗЛОЖЕНИЯ ХЛОРИРОВАННЫХ БИФЕНИЛОВ ШТАММОМ Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 В УСЛОВИЯХ ЗАСОЛЕНИЯ

Аннотация:

Штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112-7 (ВКМ Ac-2623D) разлагал моно-замещенные 2-/4-хлорированные бифенилы (94.25 мг/л) и 2,4'-дихлорбифенил (22.3 мг/л) при содержании хлорида натрия в среде культивирования до 50 г/л. Рассчитаны кинетические параметры разложения хлорбифенилов (ХБ) штаммом КТ112-7, которые показали снижение эффективности деструкции при повышении концентрации NaCl. Установлена линейная корреляционная зависимость содержания насыщенных, ненасыщенных и разветвленных жирных кислот в клеточной стенке штамма КТ112-7 от содержания NaCl в среде культивирования. Изменение содержания и состава различных жирных кислот в клеточной стенке, вероятно, приводило к изменению проницаемости клеточной стенки для ХБ. Штамм R. wratislaviensis КТ112-7 был способен окислять незамещенное кольцо 2-ХБ и 4-ХБ при всех исследованных концентрациях NaCl в среде и эффективно разлагал образующиеся при этом хлорбензойные кислоты (ХБК). Разложение 2,4'-ХБ при низком содержании NaCl (до 10 г/л) в среде происходило с окислением 4-хлорированного кольца ХБ, а в присутствии 20—50 г/л NaCl — 2-хлорированного кольца. В первом случае в качестве основного метаболита детектировали 2-ХБК, во втором - 4-ХБК. Трансформация 4-ХБК осуществлялась через стадию образования протокатеховой кислоты и катехола при всех исследованных концентрациях NaCl в среде, а при концентрации 30, 40, 50 г/л NaCl параллельно еще и по другому пути через образование хлоркатехола. Полихлорированные бифенилы (ПХБ) — токсичные химические соединения, производство и применение которых в промышленных масштабах привело к экологически неблагополучному состоянию обширных территорий России и других стран. По разным подсчетам всего было выпущено порядка 1.7 миллиона тонн данных соединений. По различным оценкам около 35% синтезированных ПХБ оказалось в природных экосистемах (в почвах, водоемах). В силу высокой токсичности и канцерогенности для живых организмов, а также химической и физической стабильности, присутствие ПХБ в окружающей среде признано экологической угрозой. Исследования последних десятилетий показали, что в естественных условиях возможна трансформация ПХБ бактериями. Разложение высокохлорированных бифенилов осуществляют анаэробные бактерии путем восстановительного дегалогенирования. При этом образуются молекулы ПХБ с меньшим количеством заместителей, однако полного удаления из среды опасных поллютантов при этом не происходит. Более перспективно их аэробное окисление, в результате которого под действием бактериальных диоксигеназ не только сокращается количество атомов хлора в молекуле ПХБ, но и осуществляется расщепление одного из бензольных колец с образованием замещенных бензойных и пентадиеновых кислот. Таким образом, наибольший интерес для решения проблемы загрязнения окружающей среды ПХБ представляют аэробные бактерии. Установлено, что способностью разлагать ПХБ до хлорбензойных кислот обладают представители родов Achromobacter, Acidovorax, Aeromonas, Arthrobacter, Bacillus, Burkholderia, Comamonas, Corynebacterium, Corynebacterium, Cupriavidus, Microbacterium, Micrococcus, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus, Sphingomonas, Sphingomonas. Наиболее подробно особенности аэробной деструкции ПХБ описаны для штаммов Burkholderia xenovorans LB400 и Rhodococcus jostii RHA1. Штаммы, где Д- эффективность деструкции (%); С, — концентрация ХБ через определенный промежуток времени (2 или 24 ч); С0 — концентрация хлорбифенила в начальный момент времени. Для описания процесса разложения ХБ при разной концентрации NaCl в среде использовали 4 математические модели анализа данных с применением аппроксимации: Сt - С0 = Kt ; Tl/2 = С0/2К0 (1) InС1 = К1t + 1nС0; Т1/2 = 1n2/К1 (2) 1/Ct= 1/С0 +K2t; Т1/2 = С0/2К2 (3) Сt = С0^е-Кt; Т1/2 = 1n0.5/-К, (4) где Сt — концентрация хлорбифенила через определенный промежуток времени; С0 — концентрация хлорбифенила в начальный момент времени; К— константа деструкции, ч-1; T1/2 — период полужизни (полуразложения) субстрата. Анализ результатов, полученных в процессе математического анализа данных, показал, что наиболее достоверно процесс разложения хлорбифенилов штаммом КТ112-7 в присутствии различных концентраций хлорида натрия описывает модель 3 (R2 = 0.908—1.0), тогда как при использовании остальных уравнений достоверность аппроксимации составляла 0.496—0.862. Экстракция липидов клеточной стенки. Культуру штамма КТ112-7 предварительно выращивали в БСР с добавлением NaCl (10—90 г/л) как описано выше. Клетки осаждали центрифугированием при 8240 g (3K30, "Sartorius", Германия) 10 мин при 20°С и высушивали до постоянной массы. Экстракцию проводили из 100 мг сухих клеток 30 мл смеси этанол — хлороформ — вода 14:7:4. Полученные экстракты центрифугировали при 15093 g 7 мин на центрифуге miniSpin ("Eppendorf", Германия). Надосадочную жидкость переносили в реакторы емкостью 3 мл, помещали их в термостат на 60 °С и упаривали досуха. Анализ жирных кислот клеточной стенки штамма КТ112-7. Анализ проводили методом газожидкостной хроматографии с пламенно-ионизационным и масс-спектрометрическим детекторами. В реакторы с экстрактами липидов добавляли 1 мл этилового спирта и 0.1 мл концентрированной серной кислоты, смесь перемешивали. Реактор помещали в водяную баню и выдерживали 30—40 мин при температуре 80 °С, затем реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры. Далее в реактор добавляли 1 мл гексана и переносили полученную смесь в мерную пробирку на 10 мл, добавляли 5 мл дистиллированной воды и проводили отмывку-экстракцию 2 раза по 2 мин. После расслоения фаз проводили анализ гексанового слоя в условиях ГХ-ПИД и ГХ-МСД. Условия ГХ-ПИД. Для анализа использовали газовый хроматограф "Shimadzu GC2010" (Япония), с пламенно-ионизационным детектором, кварцевой капиллярной колонкой ZB-5 длиной 30 м, диаметром 0.25 мм, толщина пленки 0.25 мкм. Начальная температура колонки 40°С (выдержка 3 мин), далее нагрев со скоростью 10°С/мин до 280 °С (выдержка 30 мин). Температура испарителя — 250 °С, детектора 300 °С, газ-носитель — азот, деление потока 1:30, расход через колонку 1.0 мл/мин. Объем пробы 1.0 мкл. Условия ГХ-МСД. Для анализа использовали газовый хроматограф-масс-спектрометр "Agilent GC7890A MS5975C Inert XL EI/CI" (США) с квадрупольным масс-спектрометрическим детектором, кварцевой капиллярной колонкой HP-5MS длиной 30 м, диаметром 0.25 мм. Параметры, при которых проводился анализ: толщина пленки — 0.25 мкм; электронная ионизация 70 эВ; сканирование по полному ионному току в интервале m/z 20—1000 Да; газ-носитель — гелий, деление потока 1:50, расход через колонку 1.0 мл/мин; температура колонки — начальная 40 °С (выдержка 3 мин), программирование со скоростью Ю°С/мин до 290 °С (выдержка 30 мин), температура испарителя — 250 °С, температура источника — 230 °С, квадруполя — 150 °С, переходной камеры — 280 °С, объем пробы 1.0 мкл. Идентификацию компонентов проводили на основании базы масс-спектров NIST05 и анализа индивидуальных кислот. Количественную оценку проводили на основании величины хроматографических пиков. Статистическая обработка результатов. Все эксперименты были выполнены в трехкратной повторности. Полученные данные обрабатывали с использованием стандартных пакетов компьютерных программ Microsoft Excel. Эффективность разложения ХБ при разном уровне засоления. Экспериментально было показано, что штамм Rhodococcus wratislaviensis КТ112—7 эффективно разлагал 2- и 4-замещенные моно- и ди-хлорированные бифенилы при содержании хлорида натрия в среде до 50 г/л. Уровень деструкции хлорбифенилов при этом был выше, чем у известных штаммов: Rhodococcus sp. SK-1, Rhodococcus sp. SK-2, Rhodococcus sp. SK-3 (20—66% деструкции моно-ХБ при его концентрации 94.25 мг/л и 35 г NaCl/л), Aquamicrobium sp. SK-4 (22—50% деструкции моно-ХБ при 94.25 мг/л и 30 г NaCl/л), Pseudomonas sp. СН07 (20—64% деструкции ПХБпри 100 мг/л и 17.5 г NaC1/л) и штаммов рода Bacillus (53—95% деструкции ПХБ при концентрации 20 мг/л и 0.5 г NaC1/л). Установлено, что увеличение концентрации хлорида натрия в среде приводило к снижению эффективности разложения ХБ. Анализ кинетических параметров деструкции хлорбифенилов показал, что период полуразложения моно-ХБ не изменялся при содержании хлорида натрия в среде в пределах 10—30 г/л. Повышение уровня засоления до 40 г/л приводило к его увеличению в 3 раза. Однако наиболее существенные изменения происходили при содержании NaCl в среде 50 г/л. Период полуразложения моно-ХБ увеличивался в 48—380 раз, по сравнению с этой величиной при концентрации хлорида натрия 10—30 г/л. При анализе кинетических параметров деструкции 2,4'-ХБ установлено, что эффективность деструкции находилась в обратной линейной корреляционной зависимости от содержания NaCl в среде (коэффициент корреляции — 0.96). Аналогичный эффект был отмечен при деструкции 4,4'-ХБ штаммом Stenotrofomonas sp. JSG1 при изменении содержания хлорида натрия в среде от 0 до 40 г/л 115], и разложении незамещенного бифенила штаммами родов Rhodococcus и Aquamicrobium в пределах концентраций NaCl 0.05-3.5 г/л. Увеличение концентрации хлорида натрия в среде также влияло на эффективность разложения ХБК, основных метаболитов разложения ХБ. При низких концентрациях NaCl, до 10 г/л включительно, в среде зафиксировано незначительное количество ХБК. При этом разложение 2-ХБК не сопровождалось накоплением метаболитов, а при разложении 4-ХБК отмечено незначительное присутствие 4-гидроксибензойной кислоты — первого метаболита его гидролитического дегалогенирования. Полученные результаты свидетельствовали о высокой эффективности деструкции 2- и 4-ХБК при таких условиях засоления. Как было отмечено выше, повышение концентрации хлорида натрия приводило к снижению скорости деструкции ХБ, однако при этом в среде повышалась концентрация ХБК и наблюдалась аккумуляция их метаболитов. Таким образом, присутствие в среде 20—50 г/л NaCl оказывало ингибирующее действие на разложение ХБК штаммом R. wratislaviensis КТ112-7. Соотношение жирных кислот клеточной стенки штамма КТ112-7 при изменении концентрации хлорида натрия в среде. Снижение эффективности трансформации хлорированных бифенилов штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 при повышении солености среды могло быть обусловлено изменениями в строении клеточной стенки. Известно, что повышение уровня осмолярности среды приводит к ряду изменений в составе основных компонентов клеточной стенки, в частности — в соотношении основных групп жирных кислот (ЖК). Анализ профиля процентного содержания ЖК показал, что у штамма R. wratislaviensis КТ112-7 они представлены основными группами: насыщенные, мононенасыщенные и разветвленные, что согласуется с профилем ЖК, характерным для бактерий рода Rhodococcus. Среди выявленных насыщенных ЖК преобладала пальмитиновая кислота (С 16:0 25.9%), среди мононенасыщенных жирных кислот значительная доля приходилась на гептадеценовую кислоту (С17:1 13.1%). Из полученных результатов видно, что процентное соотношение основных ЖК клеточной стенки штамма R. wratislaviensis КТ 112-7 при культивировании в среде с низкой концентрацией хлорида натрия (10 г/л) соответствует жирнокислотному профилю, описанному для вида R. wratislaviensis. Анализ изменения в соотношении основных групп ЖК клеточной стенки штамма R. wratislaviensis КТ 112-7 при повышении концентрации хлорида натрия в среде от 10 до 90 г/л выявил прямую линейную корреляционную зависимость для насыщенных и обратную линейную корреляцию для ненасыщенных и разветвленных ЖК. Коэффициент корреляции составил для насыщенных жирных кислот — 0.979, для ненасыщенных жирных кислот — 0.980, для разветвленных жирных кислот — 0.937. В литературе имеются ограниченные сведения об изменении профиля ЖК клеточной стенки штаммов рода Rhodococcus, обусловленных изменением осмолярности среды культивирования. Известно, что увеличение доли насыщенных ЖК у штамма R. erythropolis DCL14 происходит при повышении концентрации NaCl от 0.0 до 1.0 М (58.5 г/л), а значительные изменения в доле ненасыщенных и разветвленных ЖК — в пределах 30 до 75 г/л NaCl 122, 25, 261. Напротив, у штамма R. wratislaviensis КТ 112-7 изменения в соотношении основных групп жирных кислот наблюдались во всем исследованном диапазоне хлорида натрия в среде. Следует отметить, что повышение концентрации NaCl в среде приводило к снижению доли С16:1 и С 18:1 ненасыщенных ЖК. Полученные результаты согласовывались с данными по изменению концентрации С16:1 и С18:1 у штаммов R. erythropolis DCL14, Thioalkalimicrobium aerophilum AL3 и Thioalkalivibrio versutus ALJ15 в условиях повышения засоленности среды. По мнению ряда авторов, подобные изменения в соотношении ЖК в составе клеточной стенки бактерий приводят к снижению текучести и проницаемости клеточной мембраны. Таким образом, можно предположить, что снижение эффективности разложения хлорбифениловштаммом R. wratislaviensis KT112-7 при повышении концентрации хлорида натрия в среде обусловлено изменением проницаемости клеточной мембраны для ПХБ вследствие изменения соотношения основных групп ЖК, входящих в ее состав. Метаболические пути разложения хлорбифенилов. Известно, что у большинства штаммов-деструкторов бифенил 2,3-диоксигеназа (КФ 1.14.12.18) (БДО) предпочтительнее окисляет незамещенное кольцо в молекуле моно-ХБ, при этом в качестве промежуточных метаболитов образуются (хлор) бифенилдигидродиол, гидрокси-оксо-(хлор)фенил-гексадиеновая кислота (С1-ГОФДК) и ХБК. В результате спектрофотометрического анализа установлено, что при разложении 2-ХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 в присутствии 0—50 г/л NaCl образовывалась 8С1-ГОФДК с ламбдамакс = 392нм, а при разложении 4-ХБ — 10С1-ГОФДК с ламбдамакс = 436 нм. При этом в культуральной среде были зафиксированы соответствующие ХБК. Таким образом, было подтверждено, что БДОКТ112-7 осуществляла окисление моно-хлорированных бифенилов через стадию окисления незамещенного кольца при всех исследованных концентрациях хлорида натрия. При разложении ди-хлорированных бифенилов (ди-ХБ), содержащих заместители в каждом кольце молекулы, предпочтительное окисление одного из колец молекулы бифенил диоксигеназой зависит от расположения заместителей. Активность БДО штамма В. xenovorans LB400 уменьшалась от незамещенного кольца к 2-, а затемк 3-хлорированным кольцам. 4-замещенные кольца подвергались окислению БДОLB400 крайне слабо, а 4,4'-ХБ практически данным штаммом не трансформировался. Напротив, БДО штамма Pseudomonas pseudoalcaligenes KF707 проявляла высокую активность к 4,4'-ХБ, но не окисляла ХБ с заместителями во втором положении. Ранее нами описан штамм Rhodococcus sp. В7а, выделенный из техногенно загрязненной почвы, по спектру поллютантов сходной с эконишей, из которой был выделен штамма R. wratislaviensis КТ112-7, БДО которого способна окислять одновременно и 4- и 2-замещенные кольца 2,4'-ХБ. Анализ результатов показал, что активностьБДОКТ112-7 в отношении 2- или 4-хлорированного кольца 2,4'-ХБ зависела от уровня засоления среды. При концентрации хлорида натрия до 10 г/л фермент штамма R. wratislaviensis КТ112-7 окислял 4-замещенное кольцо 2,4'-ХБ, о чем свидетельствует образование 3,8С1-ГОФДК сА,макс = 415 нм [271 и 2-ХБК. В случае, когда концентрация NaCl составляла 20—50 г/л, БДОКХ112.7 проявляла активность к 2-хлорированному кольцу 2,4'-ХБ. При этом в среде были зафиксированы ЮС1-ГОФДК с Х,макс = 436 нм [271 и 4-ХБК. Как видно из табл. 3, при разложении ХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 образуются не только ХБК, но и их возможные метаболиты — гидроксибензойные кислоты (ГБК) и (хлор)катехол. Ключевой реакцией разложения хлорбензоатов является реакция дегалогенирования, при этом отщепление хлора может происходить как до окисления ароматического кольца, так и после. Ряд известных штаммов осуществляют окислительное дегалогенирование и разлагают 2-ХБК через стадию образования катехола. Напротив, при деструкции 2-ХБК штаммом Rhodococcus sp. R04 основным метаболитом является хлоркатехол. Основываясь на полученных нами данных по метаболическому профилю, можно предположить, что штамм R. wratislaviensis КТ112-7 осуществлял разложение 2-ХБК, образующейся при трансформации хлорированных бифенилов, по пути окислительного дегалогенирования с отщеплением атома хлора до разрыва ароматического кольца молекулы. При этом метаболический путь не зависел от концентрации NaCl в среде. Ключевыми метаболитами при аэробной бактериальной трансформации 4-ХБК являются 4-ГБК и 3,4-ГБК, в случае гидролитического дегалогенирования, описанного для штаммов родов Acinetobacter, Pseudomonas, Arhrobacter и Rhodococcus, либо 4-хлоркатехол, в случае отщепления атома хлора после разрыва ароматического кольца. Данный путь описан для штаммов Burkholderia cepacia PI66 и Rhodococcus sp. R04. Основываясь на полученных нами результатах, можно предположить, что в штамме R. wratislaviensis КТ112-7 присутствуют оба пути трансформации 4-ХБК. Гидролитическое дегалогенирование 4-ХБК осуществлялось при всех исследованных концентрациях хлорида натрия, что подтверждалось присутствием 4-ГБК, 3,4-ГБК и катехола в среде культивирования. Разложение 4-ХБК через стадию образования 4-хлоркатехола было отмечено в присутствии 30—50 г/л хлорида натрия. При этом 4-хлоркатехол не накапливался в культуральной среде в значительных количествах. Ранее было показано, что в ДНК штамма R. wratislaviensis КТ 112-7 содержатся гены clcA и clcF, кодирующие ферменты хлоркатехол 1,2-диоксигеназу (КФ 1.13.11.1) и хлормуконолактон-дегалогеназу (наиболее близка к муконолактон-изомеразе, КФ 5.3.3.4), соответственно. Данные ферменты осуществляли разложение 4-хлоркатехола до соединений, поступающих в цикл Кребса. Таким образом, штамм R. wratislaviensis КТ 112-7 обладал уникальным сочетанием метаболических систем, определяющих его способность к разложению 2-ХБ, 4-ХБ, 2,4'-ХБ, и продуктов их метаболизма при изменении солености среды от 0 до 50 г/л. В результате проведенных исследований изучены особенности разложения хлорбифенилов штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 в условиях засоления среды. Показано, что повышение концентрации хлорида натрия в среде от 0 до 50 г/л приводит к снижению эффективности разложения 2-ХБ, 4-ХБ, 2,4-ХБ штаммом КТ112-7. Установлено, что данный эффект может быть обусловлен изменением в соотношении основных групп жирных кислот в клеточной стенке штамма. Повышение содержания насыщенных ЖК и снижение доли ненасыщенных и разветвленных ЖК является адаптационным ответом клетки на изменение осмолярности среды. Показано, что штамм R. wratislaviensis КТ 112-7 обладал уникальным сочетанием метаболических путей разложения хлорбифенилов в условиях повышенного содержания хлорида натрия в среде. Ключевыми метаболитами при этом были ГОФДК и хлорбензойные кислоты. Ранее было отмечено, что штамм R. wratislaviensis КТ112-7 обладает двумя ферментативными системами разложения бензойной кислоты, активация которых также зависит от концентрации хлорида натрия в среде культивирования. Установлено, что разложение исследованных ПХБ штаммом R. wratislaviensis КТ112-7 происходит до соединений основного обмена клетки в не зависимости от присутствия NaCl в среде. Полученные результаты позволяют рекомендовать штамм R. wratislaviensis КТ112-7 для разработки экобиотехнологий, направленных на очистку загрязненных хлорированными бифенилами территорий, в том числе в условиях засоления.

Авторы:

Издание: Прикладная биохимия и микробиология
Год издания: 2018
Объем: 11с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.253-263. Библ. 33 назв.
Просмотров: 64