АНТАГОНИСТИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ Lactobacillus spp. В ОТНОШЕНИИ КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ Klebsiella pneumoniae

Аннотация:

В результате скрининга у 3 штаммов молочнокислых бактерий, идентифицированных как Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus reuteri и Lactobacillus helveticus, обнаружена выраженная антагонистическая активность в отношении штаммов Klebsiella pneumoniae, характеризующихся множественной устойчивостью к антибиотикам. При совместном культивировании лактобацилл и штаммов Klebsiella ингибирование роста последних составляло от 20 до 86% на первые и вторые сутки соответственно. Анализ экзопротеома штамма L. rhamnosus показал, что при совместном культивировании с Klebsiella pneumoniae происходила индукция биосинтеза пептидогликан-гидролаз лактобацилл, в том числе внеклеточных литических трансгликозилаз 2 семейства (MltA) и эндопептидаз, разрушающих пептидогликаны клеточной стенки бактерий. В настоящее время во всем мире актуальной является проблема профилактики и лечения нозокомиальных (госпитальных) инфекций. Особого внимания заслуживают нозокомиальные инфекции, вызванные антибиотикорезистентными микроорганизмами. Риск и частота развития госпитальных инфекций во всем мире постоянно увеличиваются. Так, в США проблема распространения резистентных микроорганизмов рассматривается как угроза национальной безопасности. В 2017 г. Всемирной организацией здравоохранения (ВОЗ) опубликован список устойчивых к действию антибиотиков бактерий, представляющих наибольшую угрозу для здоровья человека. Список разработан в рамках деятельности ВОЗ по борьбе с растущей проблемой устойчивости микроорганизмов к противомикробным препаратам, и призван стать ориентиром и стимулом для научных исследований в области создания новых антибиотиков. Грамотрицательные бактерии являются широко распространенной группой микроорганизмов, часто вызывающих тяжелые клинические формы инфекции — пневмонию и сепсис, которые нередко являются причиной смерти больных. Значение этих микроорганизмов особенно велико при возникновении инфекции в больничных условиях, так как создается вероятность ее внутрибольничного распространения в стационарах различного профиля: хирургических, ожоговых, онкологических, урологических отделениях, отделениях реанимации и интенсивной терапии, отделениях недоношенных новорожденных и др., когда госпитальные штаммы проникают в организм больного и вызывают инфекционный процесс контактно-бытовым, воздушно-капельным путем, через медицинское оборудование и медикаменты. Инфекционные заболевания, вызываемые госпитальными штаммами, нередко трудно поддаются лечению, так как возбудители характеризуются множественной устойчивостью к антибиотикам. Большую опасность представляют грамотрицательные бактерии рода Klebsiella. Бактерии рода Klebsiella spp. часто обладают множественной антибиотикорезистентностью, при этом детерминанты резистентности циркулируют среди различных штаммов, превра щая их в настоящий бич стационаров.Для эффективного преодоления резистентности возбудителей оппортунистических инфекций и разработки рациональной терапии инфекционных состояний необходим поиск новых антимикробных агентов. Одним из современных направлений в данной области являются исследования антимикробного потенциала пробиотических молочнокислых бактерий. Микроорганизмы рода Lactobacillus широко распространены в природе, а некоторые виды являются важнейшими представителями микробиоты человека. Лактобациллы уже давно привлекают внимание ученых с точки зрения возможности их использования для сохранения здоровья населения, профилактики и лечения многих заболеваний различной этиологии. Благодаря продукции органических кислот (молочная, уксусная, пропионовая), перекисей и бактериоцинов многие штаммы лактобацилл проявляют выраженную антагонистическую активность в отношении многих патогенных микроорганизмов. Необходимо получение новых знаний о биологических свойствах лактобацилл для создания пробиотических продуктов и лечебных препаратов на их основе. Цель работы — изучение антагонистического действия коллекционных штаммов молочнокислых лактобактерий в отношении антибиотикорезистентных штаммов Klebsiella spp., возбудителей внутрибольничной инфекции. Штаммы бактерий и методы культивирования. Объектами исследования являлись молочнокислые бактерии рода Lactobacillus, находящиеся в Коллекции микроорганизмов Всероссийского научно-исследовательского института молочной промышленности (ВНИМИ, Москва) и штаммы Klebsiella spp., предоставленные Федеральным научным центром трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова Минздрава России (Москва). Штаммы лактобактерий хранились в замороженном состоянии при температуре минус 80 °С в растворе, содержащем 6% обезжиренного сухого молока и 10% глицерина. Восстановление культур лактобактерий проводили в MRS-бульоне и термостатировали при температуре (37 ± 1) °С в течение 24 ч до интенсивного помутнения среды. Инокуляты лактобактерий и госпитальных штаммов Klebsiella spp. получали культивированием в MRS-бульоне при 37± 1 °С. Изучение антагонистической активности молочнокислых лактобактерий. Антагонистическую активность в отношении штаммов Klebsiella spp. определяли методом совместного культивирования в MRS-среде при температуре 37 ± 1 °С в течение 48 ч. Для совместного культивирования штаммов в 20 мл питательной среды MRS вносили по 1 мл инокулята лактобацилл и Klebsiella spp. (107—108 КОЕ/мл). Подсчет количества клеток Klebsiella spp., выросших в монокультуре на среде СПА (приняты за 100%) и в присутствии лактобактерий проводили через 24 и 48 ч. Идентификация коллекционных штаммов Lactobacillus spp. Идентификацию проводили с использованием биохимической тест-системы API 50 СН (bioMerieux SA, Франция) согласно протоколам производителя и молекулярно-генетического метода на основе анализа нуклеотидной последовательности гена 16SpPHK. Культуры выращивали на среде MRS-агар ("bioMerieux SA", Франция) в анаэробных условиях в течение 2 сут при температуре 37 ± 1 °С. Для проведения молекулярно-генетической идентификации отбирали одиночные колонии исследуемых штаммов молочнокислых бактерий, выросшие на MRS-aгape в течение 48 ч при температуре 37 °С. Бактериальные клетки переносили в 1 мл стерильного физиологического раствора, суспендировали и осаждали центрифугированием при 10 000 g в течение 2 мин. Выделение бактериальной ДНК и амплификацию фрагментов генов 16SpPHK с помощью полимеразной цепной реакции (ГИДР) осуществляли по методу, описанному в работе. Для амплификации фрагмента гена 16SpPHK использовали универсальные прокариотические праймеры: Секвенирование ПЦР-продуктов проводили в лаборатории "Евроген" (Россия) на генетическом анализаторе "ABIPRISM 3100" ("AppliedBiosystems", США). Результаты обрабатывали с помощью программы BioEdit 7.1.3.0. Процедуру множественного выравнивания последовательностей проводили по алгоритму ClustalW. Идентификацию видовой принадлежности осуществляли путем сравнения полученных последовательностей с базой данных GenBank (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/blast) (NCBI, США). Идентификация и определение антибиотикорезистентности внутрибольничных штаммов Klebsiella spp. Первичный посев клинического материала проводили на следующие питательные среды: кровяной агар, среда Эндо, маннит-солевой агар, энтерококковый агар, среда Сабуро. Выделение чистой культуры микроорганизмов и окраску по Граму осуществляли в соответствии с. Родовую и видовую принадлежность изучаемых микроорганизмов определяли с помощью бактериологического анализатора Walk Away 96 Plus ("Beckman Coulter", США) с использованиемпанелей MicroScan NBC 44, предусматривающих возможность определения чувствительности к антибактериальным препаратам. Панель включала следующие антибиотики: амикацин, амоксициллин/клавулановая кислота, ампициллин/сульбактам, ампициллин, азтреонам, цефазолин, цефепим, цефотаксим, цефотаксим/клавулановая кислота, цефоксигин, цефтазидим, цефтазидим/клавулановая кислота, цефтриаксон, цефуроксим, цефалотин, ципрофлоксацин, эртапенем, гентамицин, имипенем (тиенам), левофлоксацин, меропенем, нитрофурантоин, пиперациллин/тазобактам, пиперациллин, тетрациклин, тигециклин (тигацил), тобрамицин, триметоприм/сульфаметоксазол. Используемый анализатор оценивал чувствительность микроорганизма к антибиотикам с указанием ее категории: S — чувствительный, I — промежуточная чувствительность, R —резистентный; МИК — минимальная ингибирующая концентрация (мкг/мл). Определение чувствительности изолятов к полимиксину В и колистину осуществляли на среде Мюллера — Хинтона диско-диффузионным методом. Анализ экзопротеома лактобактерий. Для анализа бактериальные клетки отделяли от культуральной жидкости (КЖ) центрифугированием при 8000 g 40 мин. КЖ концентрировали в 10 раз и одновременно обессоливали с помощью системы ультрафильтрации в тангенциальном потоке, используя мембрану 5 кДа ("Millipore", США). Белки осаждали смесью ацетон-13.3% трихлоруксусная кислота (ТХУ)— 0.093% бета-меркаптоэтанол в соотношении образец:осадитель — 1:1 в течение 12 ч при температуре минус 20°С. Осадок отделяли центрифугированием 20 мин, при 3000 g и дважды промывали 0.07%ным бета-меркаптоэтанолом в ацетоне. Для удаления остатков растворителя осадок подсушивали 5 мин при 20°С в потоке воздуха. Полученный осадок растворяли в лизис-буфере, следующего состава: дитиотреитол - 1% (ДТТ), CHAPS - 4%, 7 М мочевина; 2 М тиомочевина; амфолиты — 3/10—5% ("Serva Electrophoresis", Германия), и обрабатывали ультразвуком в течение 10 мин при 20°С. После обработки реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при 20°С и затем центрифугировали 5 мин при 10 000 g. Супернатант использовали для дальнейших исследований. Двумерный электрофорез (2-DE) проводили по методике, описанной в работе на системе PROTEAN II xi 2-D Cell ("Bio-Rad", США). При проведении изоэлектрофокусирования градиент рН — от 3 до 10. Количество образца — 200 мкг белка на трубку. Изофокусирование проводили в течение 16 ч при следующих режимах: 100 В — 45 мин. 200 В - 45 мин. 300 В - 45 мин. 400 В 45 мин, 500 В - 45 мин, 600 В - 45 мин, 700 В - 10 ч, 900 В-1.5 ч. Последующий электрофорез образцов проводили в градиентном акриламидном Na-ДДС-геле (7.5—25%) при напряжении 300 В. Перед нанесением образцы инкубировали 20 мин в растворе, содержащем: 6 М мочевина, ДДС-Na - 2%, 10 мМ ДТТ, 0.5 М трис-HCl, рН 6.8, для предотвращения окисления сульфгидрильных групп в белках. Для визуального анализа распределения белковых компонентов гели окрашивали азотнокислым серебром. Анализ белковых 1 карт проводили при помощи ПО ImageMaster 2D Platinum, v.7 ("GE Healthcare", США). Для масс-спектрометрического анализа проводили трипсинолиз вырезанных из гелей белков в течение 8 ч при 37 °С. В качестве матрицы использовали раствор 2,5-дигидроксибензойной кислоты ("Aldrich", США) 10 мг/мл в 20%-ном водном ацетонитриле и 0,5%-ном ТФУ. Масс-спектры были получены на MALDI-времяпролетно-времяпролетном масс-спектрометре Ultraflex II BRUKER ("Bruker", Германия). Спектры получали в диапазоне масс 700—4500 m/z. Для получения спектров фрагментации использовали тандемный режим прибора, точность измерения фрагментных ионов была не ниже 1 Да. Идентификацию белков проводили при помощи программы Mascot (www.rnatrixscience.corr)), используя опцию "пептидный фингерпринт". Был проведен поиск в базе данных NCBI (www.ncbi. nlm.nih.gov) среди белков всех организмов, с учетом возможного окисления метионинов кислородом воздуха и возможной модификации цистеинов акриламидом геля. Кандидатные белки, имеющие параметр достоверности (score) > 85 в базе данных NCBI считали надежно определенными (р<0.05). С использованием программного обеспечения Biotools 3.2 ("Bruker Daltonics", Германия) проведен поиск по объединенным MS+MS/MS результатам. Определение содержания органических кислот. Содержание молочной, уксусной и прогшоновой кислот анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на приборе Agilent Infinity 1290 (США) с детекцией на диодно-матричном детекторе при длине волны 210 нм с использованием колонки Zorbax SB-C8 (4.6 х 50 мм, 1.8 мкм). Пробы для анализа подготавливали следующим образом: культуральную жидкость после отделения бактериальной биомассы, фильтровали через мембрану с размером пор 5 кДа; к 0.2 мл осветленной культуральной жидкости добавляли 1 мл метанола, встряхивали и осаждали при температуре —18 °Св течение 30 мин; осадок отделяли центрифугированием (5 мин, 10 ООО g), к 0.2 мл супернатанта добавляли 0.8 мл деионизованной воды. На колонку наносили 10 мкл подготовленной пробы. Элюцию проводили 20 мМ фосфатным буфером, рН 2.0, содержащем 1 % ацетонитрил при температуре 35 °С и скорости протока элюента 0.4 мл/мин. В качестве стандартов использовали водные растворы органических кислот ("ACROS", Бельгия). Времена удерживания для молочной, уксусной и пропионовой кислот составляли 2.0, 2.28 и 4.78 мин соответственно. Идентификация и определение антибиотикорезистентности внутрибольничных штаммов Klebsiella spp. В настоящее время отмечается растущая из года в год устойчивость клинических изолятов бактерий — возбудителей нозокомиальных (госпитальных) инфекций, к различным группам антибиотиков. В Федеральном научном центре трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова штаммы Klebsiella pneumoniae составляют до 95% всех клинических изолятов Klebsiella spp., выделенных из крови, трахеи, мочи, дренажей и др. в 2016—2017 гг. В дальнейшей работе было использовано пять внутрибольничных изолятов 2016—2017 гг., идентифицированных как Klebsiella pneumoniae и характеризующихся множественной устойчивостью к различным группам антибиотиков. Изоляты № 4 и № 5 обладали чувствительностью к карбапенемам (за исключением эртапенема), аминогликозидам, полимиксинам и др. Кроме того, изолят № 5 показал чувствительность к защищенным пенициллинам (ампициллин/сульбактам, амоксициллин/клавулановая кислота, пиперациллин/ тазобактам) и фторхинолонам. Три изолята Klebsiella pneumoniae № 1, № 2 и № 3 из пяти, используемых в данной работе, показали устойчивость к антибиотикам следующих групп: пенициллинов, цефалоспоринов, фторхинолонов, карбапенемов и аминогликозидов. При этом изоляты № 1 и № 3 имели промежуточную чувствительность к тигециклину, а изолят № 1 был чувствителен к полимиксинам (изолят № 3 к этой группе не исследовали). Основным механизмом устойчивости К. pneumoniae к бета-лактамным антибиотикам является наличие целого спектра гидролитических ферментов — бета-лактамаз, в том числе бета-лактамаз с карбапенем-гидролазной активностью, известных как карбапенемазы: металло-бета-лактамазы VIM, IMP, NDM типов; сериновые карбапенемазы групп КРС, ОХА-48 и GES2/5, гидролизующих пенициллины, цефалоспорины и карбапенемы. Изоляты № 1 и № 3 проявляли устойчивость ко всем антибиотикам, крометигециклина и полимиксина, что характерно для продуцентов карбапенемаз NDM-типа, так как данный фермент эффективно гидролизует множество бета-лактамов, включая пенициллины, цефалоспорины и карбапенемы. При этом для продуцентов NDM карбапенемаз также характерно наличие ассоциированной устойчивости к антибиотикам других групп (аминогликозидам, фторхинолонам). В 2015 г. описан первый случай выделения (раневая инфекция после открытого перелома голени) штамма Klebsiella pneumoniae — продуцента карбапенемазы NDM-1 (установлено наличие гена blaNDM). Изолят проявлял устойчивость ко всем бета-лактамам, аминогликозидам и фторхинолонам, но сохранял чувствительность ктигециклину и полимиксину В. Изолят № 2 обладал устойчивостью ко всем протестированным группам антибиотиков (группа полимиксинов для этого изолята не тестировалась). Реальной угрозой в течение последних нескольких лет являются штаммы К. pneumoniae, вырабатывающие карбапенемазы ОХА-48-группы, данные штаммы К. pneumoniae устойчивы почти ко всем известным антибактериальным препаратам и в 40—61 % случаев приводят к летальному исходу. Так за последние три года в Российском онкологическом научном центре отмечено увеличение с 8.6% до 36.1% количества штаммов К. pneumoniae ОХА-48. Таким образом, протестированные в данной работе изоляты К. pneumoniae, обладающие множественной устойчивостью к антибиотикам, оставались чувствительными к группе полимиксинов (изоляты № 1 и № 3, изоляты № 2, № 4 и № 5 не тестировались). Однако в 2015 г. был обнаружен новый ген резистентности бактерий к полимиксинам, расположенный на подвижной плазмиде MCR-1, которая посредством конъюгации и активного горизонтального переноса способна быстро распространяться между различными видами бактерий, втом числе неродственными. Продуктом гена MCR-1 является фермент семейства фосфоэтаноламинтрансфераз способный модифицировать липид А путем добавления фосфоэтаноламина, что приводит в свою очередь к снижению отрицательного заряда липополисахарида, расположенного на поверхности грамотрицательных бактерий, и, как результат, препятствует связыванию колистина с мишенью. Наличие генов устойчивости к полимиксинам в сочетании с другими механизмами резистентности делает бактериюустойчивой ко всем существующим сегодня группам антибактериальных препаратов. В связи с чем, в настоящее время активно проводятся работы по поиску новых эффективных в отношении антибиотикорезистентных штаммов бактерий антимикробных агентов. Среди прочего в этом направлении интенсивно изучаются антимикробные свойства пробиотических лактобактерий. Идентификация и антагонистическая активность лактобактерий рода Lactobacillus spp. Проведенный скрининг антагонистической активности молочнокислых бактерий из коллекции ВНИМИ в отношении антибиотикорезистентных госпитальных изолятов Klebsiella pneumoniae выявил три наиболее активных штамма, относящихся к семейству Lactobacillaceae, роду Lactobacillus, видам Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus reuteri и Lactobacillus casei в соответствии с паспортными данными. Результаты биохимической идентификации штаммов лактобацилл с использованием тест-системы API 50 CHL показали, что штамм L. reuteri LR1 относился к виду Lactobacillus fermentum, который по литературным данным считается близким кL. reuteri, штамм L. casei Ф к виду Lactobacillus rhamnosus и штамм L. acidophilus NK1 к виду Lactobacillus acidophilus. Поскольку идентификация молочнокислых бактерий только на основании биохимических признаков в настоящее время является недостаточной, ввиду их фенотипической изменчивости под воздействием различных факторов, была проведена также молекулярно-генетическая характеристика выявленных активных штаммов. Данные сравнительного анализа нуклеотидной последовательности генов 16SpРНК с последовательностями 16SpPHK референтных штаммов Lactobacillus из базы данных GenBank (NCBI, США) позволили однозначно идентифицировать родовую и видовую принадлежность исследованных штаммов Lactobacillus. Результаты биохимической и молекулярно-генетической идентификации штамма L. rhamnosus Ф (по паспортным данным L. casei Ф) совпадали. В то же время штаммы L. acidophilus NK1 и L. reuteri LR1, которые были идентифицированы с использованием тест-системы API 50 CHL как Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus fermentum по гену 16SpPHK отнесены к виду Lactobacillus helveticus и Lactobacillus reuteri соответственно. Это можно объяснить тем, что биохимические профили L. reuteri и L. fermentum близки друг другу по способности сбраживать арабинозу, рибозу, мальтозу, лактозу, мелибиозу, ксилозу, галактозу, глюкозу и раффинозу, поэтому L. reuteri был идентифицирован как L. fermentum биотип II. L. helveticus и L. acidophilus имели также близкую биохимическую активность, а именно по способности к сбраживанию галактозы, глюкозы, фруктозы, маннозы, мальтозы, лактозы и трегалозы. На рис. 1 представлены результаты по исследованию степени подавления внутрибольничных изолятов Klebsiella pneumoniae штаммами лактобацилл. Наиболее выраженной антагонистической активностью по отношению к клебсиеллам обладали штаммы L. reuteri LR1 и L. acidophilus NK1 (L. helveticus). Так через 24 ч сокультивирования степень подавления изолятов госпитальных штаммов клебсиелл варьировала в пределах 56—73% для L. reuteri LR1 и 42—73% для L. acidophilus NK1 (L. helveticus). Штамм L. casei Ф (L. rhamnosus) показал меньшую степень подавления роста патогена 19—31%. Через 48 ч совместного культивирования подавление роста клеток клебсиелл лактобациллами составило 70—86%, 60—73% и 45—73% дляштаммов L. acidophilus NK1 (L. helveticus), L. reuteri LR1 и L. casei Ф (L. rhamnosus) соответственно. Из результатов видно, что после 2 сут культивирования наибольшая степень подавления была отмечена у L. acidophilus NK1 (L. helveticus). Необходимо также подчеркнуть, что степень подавления роста отдельных изолятов госпитальных штаммов изменялась в зависимости от штамма. Штамм L. casei Ф (L. rhamnosus) показал более широкую вариабельность в подавлении роста различных изолятов клебсиелл, по сравнению с двумя другими штаммами Lactobacillus. Наименьшую активность штамм L. casei Ф (L. rhamnosus) проявлял в отношении изолятов № 3 и № 5. Наибольший антагонистический эффект L. reuteri LR1 показал в отношении изолятов № 1, № 3, № 5 (около 73%), L. acidophilus NK1 (L. helveticus) — изолятов № 2, № 3, № 5 (около 86%) и L. casei Ф (L. rhamnosus) — № 1, № 2 (около 73%). Такая избирательность в отношении разных изолятов К. pneumoniae, вероятно, может быть обусловлена различиями в адаптационном ответе исследуемых штаммов лактобацилл и соответственно спектре секретируемых ими метаболитов белковой и небелковой природы. Многочисленные протеомные исследования различных видов Lactobacillus показали возможные механизмы их адаптации к стрессовым условиям окружающей среды, таким как повышенные температура, кислотность, содержание желчных кислот и солей, а также присутствие в ростовой среде бактерий другого вида или рода. Эти исследования подчеркнули, что в ответ на стресс в дополнение к общим механизмам регуляции, у отдельных штаммов лактобацилл могут включаться и выключаться специфические метаболические пути, изменяя их ответ или ответные реакции и позволяющие приспосабливаться к изменяющимся условиям, что в свою очередь приводит к качественному и количественному изменению в составе секретомов лактобацилл. Более того разные штаммы бактерий одного и того же вида могут иметь значительно различающийся профиль как поверхностно связанных и интегрированных в клеточную стенку, так и секретируемых белков. Сравнительный протеомный анализ двух хорошо известных пробиотических штаммов Lactobacillus rhamnosus GG и Lc705 показал, что штамм GG экспрессирует более 90 уникальных белков, а штамм Lc705 более 150 белков, альтернативных аналогов, которых нет у других штаммов. Сравнительный секретомный (экзопротеомный) анализ L. casei Ф (L. rhamnosus). Поскольку именно бактериальный экзопротеом отвечает за гидролиз макромолекул, находящихся в среде, таких как полисахариды и белки, всасывание питательных веществ, связь с другими прокариотическими и эукариотическими клетками и колонизацию субстратов (в том числе эпителиальных клеток кишечника человека), в работе был проведен сравнительный секретомный (экзопротеомный) анализ штамма L. casei Ф (L. rhamnosus) при выращивании на MRS-бульоне как монокультуры, так и при совместном культивировании на той же среде с изолятом № 2 К. pneumoniae (штамм показал устойчивость ко всем протестированным антибиотикам). Проведенная биохимическая характеристика коллекционных штаммов показала, что штамм L. casei Ф (L. rhamnosus) был способен сбраживать примерно в два раза больше различных Сахаров, по сравнению с L. acidophilus NK1 и L. reuteri LR1. Действительно, известно, что геномы молочнокислых бактерий рода Lactobacillus spp. содержат большое количество генов, участвующих в транспорте и утилизации углеводов. При этом существует высокая как межвидовая, так и внутривидовая вариабельность. Виды лактобацилл с большим размером генома (такие как Lactobacillus plantarum, L. casei и L. rhamnosus) могут использовать в качестве субстратов широкий спектр сложных углеводов и, как результат, обладают наибольшей способностью к колонизации, по сравнению с видами, имеющими меньший размер генома и способными утилизировать только простые сахара. Для проведения дальнейших исследований был выбран штамм L. casei Ф (L. rhamnosus) как более перспективный для использования в качестве пробиотической культуры среди двух других выявленных штаммов лактобацилл, обладающих антагонистической активностью. В табл. 5 представлены результаты идентификации белковых профилей (экзопротеомов) монокультуры штамма L. casei Ф (L. rhamnosus) и при совместном культивировании с изолятом № 2 К. pneumoniae (штамм с устойчивостью ко всем протестированным антибиотикам) при выращивании на MRS-бульоне в течение 24 ч. Сравнительный анализ состава внеклеточных белков методом двумерного электрофореза показал значительные различия в общей картине распределения белковых компонентов при совместном культивировании с К. pneumoniae. Как видно из приведенных результатов, продукция белков характеризовалась изменениями, как на качественном, так и количественном уровнях. В экзопротеоме монокультуры штамма L. casei Ф (L. rhamnosus) методом масс-спектрометрии был идентифицирован ряд белков, в том числе белки — гомологи глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФДГ, GAPDH): mltA-подобные литические трансгликозилазы и гликозид-гидролазы (эндопептидазы) семейства NlpC/P60. В присутствии К. pneumoniae общее количество белков в экзопротеоме лактобациллы увеличивалось, в томчисле расширялся спектр литических трансгликозилаз 2-го семейства (MltA), значительно возрастала продукция Zn-зависимой протеазы (в 2.7 раз) и появлялась дополнительная пептидогликан-эндопептидаза (гликозид-гидролаза семейства NlpC/ Р60). Необходимо отметить, что продукция одного из белков-гомологов GAPDH оставалась неизменной, в то время как интенсивность окраски другого GAPDH уменьшалась в 2.5 раза. При этом появлялся новый белковый компонент, идентифицированный тоже как GAPDH и имевший изоэлектрическую точку в более щелочной области (pi 7.1), вероятно, являющийся другой изоформой этого фермента. GAPDH является ферментом с мунлайтинг-функцией (moonlighting-ферменты), для которых показана диссоциация с клеточной стенки бактерий в условиях стресса, в том числе при щелочных или кислых рН среды. Механизм изменения места локализации цитозольных белков с мунлайтинг-функцией до конца не ясен. Таким образом, функциональными группами белков секретома L. rhamnosus, продукция которых изменялась в ответ на присутствие клебсиеллы в среде культивирования, были белки углеводного обмена и гликолиза (CMG), протеолитической системы (PS), а также белки клеточной стенки и катаболических процессов (CW-CPs). Причем, последняя группа была наиболее представленной. Пептидогликан клеточных стенок постоянно реконструируется во время роста и размножения бактерий под действием множества пептидогликан-гидролаз (PGH), которые вовлечены в такие процессы как отделение дочерних клеток, обновление клеточной стенки и автолиз в стационарной фазе роста. Ферменты группы PGH также участвуют во многих других процессах, таких как адгезия, образование биопленок, активация дормантных клеток. На основании in silico анализа геномов PGH Lactobacillus разделены на четыре класса: N-ацетилглюкозаминидазы или мурамидазы; литические трансгликозидазы; N-ацетилмурамоил-L-аланинамидазы и эндопептидазы NLPC/P60 или CHAP семейств. Представленность членов в каждой группе может варьировать у разных лактобацилл. Так в геноме L. plantarum WCFS1 среди семейства PGH наиболее многочисленны литические трансгликозилазы, в то время как в геноме L. reuteri DSM 20016 — эндопептидазы. PGH имеют модулярную организацию и, по меньшей мере, 7 типов доменов, биологические функции которых неизвестны, обнаружены в дополнение к доменам, отвечающим за связывание с клеточной стенкой (LysM и SH3 домены). Показано изменение уровня продукции литических трансгликозидаз у L. plantarum DC400 при сокультивировании с двумя другими лактобациллами L. plantarum DPPMA20 и Lactobacillus sanfranciscensh DPPMA174. Интересно, что при сокультивировании L. plantarum DC400 с другим штаммом того же вида (L. plantarum DPPMA20) содержание трансгликозилаз в секретоме уменьшается в 10 раз, в то время как при совместном культивированиис лактобациллой другого вида (L. sanfranciscensis DPPMA174) — увеличивается в 2 раза. Таким образом, можно предположить, что появление в экзосекретоме L. casei Ф (L. rhamnosus) большого спектра лигических трансгликозилаз при сокультивировании с К. pneumoniae связано с их способностью лизировать клеточную стенку грамотрицательных клебсиелл подобно лизинам бактериофагов, что может быть одним из возможных механизмов проявления антагонистической активности данного штамма лактобациллы L. rhamnosus. Это не исключает и других механизмов, таких как, например, синтез бактериоцинов. Что касается продукции органических кислот, то содержание молочной, уксусной и пропионовой кислот в культуральной жидкости при росте монокультуры L. casei Ф (L. rhamnosus) было даже чуть меньше, чем при сокультивировании с К. pneumoniae: 573, 6993, 1549 мкг/мл для молочной, уксусной и пропионовой кислот соответственно для монокультуры и 236, 5854, 1242 мкг/мл соответственно для смешанной культуры. При проведении исследований использовалось оборудование Центра коллективного пользования "Промышленные биотехнологии" Федерального государственного учреждения Федеральный исследовательский центр "Фундаментальные основы биотехнологии" Российской академии наук.

Авторы:

Издание: Прикладная биохимия и микробиология
Год издания: 2018
Объем: 13с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.264-276. Библ. 26 назв.
Просмотров: 532