ГИДРОЛИЗ БЕЛКОВ СОИ И РАПСА ФЕРМЕНТНЫМ ПРЕПАРАТОМ ПРОТОСУБТИЛИН

Аннотация:

Проведено сравнительное изучение процесса гидролиза белков сои и рапса отечественным ферментным препаратом протосубтилин, широко используемым в кормопроизводстве. Полученные продукты проанализированы методами электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na, ВЭЖХ и масс-спектрометрии. Для получения гидролизатов использовали коммерческий белковый изолят сои, белки рапса выделяли из жмыха щелочной экстракцией. Низкомолекулярные примеси удаляли методом ультрафильтрации. Показано, что степень гидролиза белков зависела от количественного соотношения субстрата и ферментного препарата, времени гидролиза и концентрации белка. Ферментолиз белков рапса протосубтилином при соотношении фермент/белок 1:20 и времени гидролиза 20 ч приводил к полному расщеплению исходных белков. При этом накапливались олигопептиды с молекулярной массой ниже 14 кДа и свободные аминокислоты, доля которых от массы исходного белка составляла 53 и 8% соответственно. В отличие от белков рапса на начальных стадиях гидролиза белков сои отмечалось значительное желирование белков и образование нерастворимых фрагментов, не поддающихся гидролизу. В растворимой части гидролизата содержались короткие олигопептиды и свободные аминокислоты, в сумме составлявшие только 13% от массы исходного белка. Соя и рапс являются наиболее перспективными источниками белка растительного происхождения, все более широко заменяющего рыбную муку в кормах для животноводства, птицеводства и рыбоводства. В связи с тем, что запасы пород рыб, используемых для приготовления рыбной муки, становятся все более ограниченными, разработка альтернативных кормов становится актуальной с развитием аквакультуры во всем мире. Огромные объемы производства указанных масличных культур обеспечивают широкую доступность таких продуктов их переработки, как жмых, шрот, мука, и получаемых из них белковых концентратов и изолятов с относительно высоким содержанием белков. Аминокислотный состав соевых и рапсовых белков хорошо сбалансирован, содержит все незаменимые аминокислоты, но отличается пониженным содержанием цистеина и метионина. Получение гидролизатов белков сои и рапса увеличивает доступность белков растительного происхождения для пищеварительной системы животных, и таким образом расширяет возможности использования этих белков в кормопроизводстве. Однако, введение белковых изолятов и концентратов из сои и рапса в рацион животных осложняется присутствием в них антипитательных веществ, не усваиваемых и даже вредных для здоровья и развития животных и снижающих переваривание и адсорбцию пищевых компонентов. К ним относятся ингибиторы пищеварительных ферментов, глкжозинолаты, производные фенола, сапонины, фитиновая кислота и ряд других соединений. Для удаления этих соединений требуется введение дополнительной стадии очистки белковых изолятов и концентратов. Второй проблемой является достаточно большой размер белков, их склонность к агрегации и желированию (особенно соевых белков), а также их частичная денатурация при тепловой обработке в процессе отжима и экстракции масла из семян этих масличных культур. При введении белковых добавок растительного происхождения в стартовые корма для рыбной молоди, выращиваемой в аквакультуре, особое значение приобретает получение белковых гидролизатов. Традиционно в стартовых кормах для рыбной молоди использовались гидролизаты рыбной муки.Поскольку активность щелочных и кислых протеиназ кишечника у личинок рыб недостаточно высока, то на стадии постэмбрионального развития белок корма должен содержать свободные аминокислоты, ди-, олиго- и полипептиды, а также низкомолекулярные растворимые белки в соотношениях, близких к составу планктонных организмов, являющихся естественной пищей для большинства рыб, в том числе молоди. Использование соевого белка интенсивно изучается в течение длительного времени. В настоящее время производители его гидролизатов применяют вместо сильных кислот мягкие ферментативные способы гидролиза белков, не приводящие к нежелательным побочным реакциям или продуктам. Однако при протеолитическом гидролизе соевых белков возникает основная проблема, связанная с образованием нерастворимых фрагментов, коагуляцией гидролизатов и высокой стоимостью ферментов. Исследований, касающихся получения продуктов диспергированного белка растительного происхождения с заданной глубиной гидролиза, в настоящее время недостаточно. В работах для гидролиза белков сои и рапса были использованы зарубежные коммерческие ферментные препараты Flavourzyme 1000L ("Merck", Германия), Novozyme FM 2.0 L и Alcalase 2.4 L ("Novozymes", Дания). В предыдущих работах было описано получение гидролизатов белков сои и рапса при действии ферментного препарата из гепатопанкреаса камчатского краба. Цель работы — сравнительное изучение процесса гидролиза белков сои и рапса отечественным коммерческим препаратом протосубтилин и анализ состава получаемых гидролизатов. В работе использовали: соевый изолят ШАНЬСУН-90 (группа предприятий "Янта" и "Атлант", Россия) с содержанием сырого белка 92% (по данным производителя), жмых рапсовый ("Грейнлюкс", Россия) с содержанием сырого белка 37.3% (ГОСТ 11048—95), ферментный препарат протосубтилин ГЗх ("Сиббиофарм", Россия) и химические реактивы ("Sigma", США). Протосубтилин. Перед использованием препарат промывали дистиллированной водой (1:10, вес/об.), отделяли нерастворимый материал центрифугированием при 25000 g на центрифуге J2—21 ("Beckman", США) в течение 15 мин, супернатант концентрировали ультрафильтрацией через мембрану 3 кДа на ячейке Millipore ("Millipore", США) и высушивали лиофильно. Получение белкового препарата из жмыха рапса. Исходный материал растирали в ступке в течение 15 мин до получения тонкого порошка. Порошок промывали при перемешивании 60%-ным этиловым спиртом в течение 30 мин и центрифугировали при 25000 g в течение 15 мин. Осадок высушивали на воздухе. Далее проводили экстракцию белков из подсушенного препарата 0.5 М NaCl в течение 2 ч при рН 10.5 и интенсивном перемешивании при комнатной температуре. Соотношение порошок — жидкость составляло 1—3% (вес\об.). Суспензию доводили 2 М NaOH до рН 10.5. Нерастворимые растительные остатки удаляли центрифугированием при 35 000 g 20 мин. Супернатант подвергали ультрафильтрации через мембрану с размерами пор 10 кДа для удаления низкомолекулярных соединений, экстрагирующихся вместе с белками. В процессе ультрафильтрации раствор белков несколько раз разбавляли либо водой (рН 8.0), либо буфером (рН 8.0) для сохранения концентрации белков, близкой к их концентрации в исходном экстракте. Для удаления соли белки осаждали 80%-ным этиловым спиртом в течение 2 ч на холоду, осадок отделяли центрифугированием, суспендировали или в воде (рН 8.0) и высушивали лиофильно, либо 0.1 М трис-HCl в буфере, рН 7.5, и использовали для ферментативного гидролиза. Определение содержания суммарного белка в исходном материале и в белковых препаратах проводили методом Кьельдаля. Анализ белковых препаратов на полифенолы. Анализ на содержание полифенолов проводили с помощью качественной цветной реакции с хлоридом железа (III). При добавлении к водным растворам полученных белковых препаратов 2—3 капель 5%-ного раствора FeCl3 изменения окраски растворов не происходило, что указывало на отсутствие в них соединений фенола. Гидролиз белковых препаратов. Гидролиз препаратов (10—15 мг) проводили в течение различного времени с использованием протосубтилина ГЗх без предварительной денатурации при рН 7.5 и комнатной температуре. Концентрация белка в реакционной смеси составляла 3 мг/мл, соотношение фермент/субстрат — 1:20 или 1:100 (вес/об.). В течение гидролиза по мере закисления поддерживали значение рН реакционной среды, равным 7.5. Реакцию останавливали нагреванием в течение 2 мин при 90 °С. Гидролизаты охлаждали и хранили в замороженном состоянии при —20 °С. Концентрацию белков определяли методом Брэдфорда. Электрофорез в ПААГ. Электрофорез белковых препаратов и гидролизатов проводили по методу Лэмли в 15%-ном ПААГ в присутствии 10%-ного ДДС-Na. Аминокислотный анализ. Для проведения аминокислотного анализа белки и пептидыгидролизовали 5.6 М НС1 в течение 24 ч при 110°С. Анализ проводили на аминокислотном анализаторе SYKAM S430 ("Sykam", Германия). Суммарное содержание свободных аминокислот в гидролизатах определяли также на аминокислотном анализаторе. Масс-спектрометрический анализ белковых гидролизатов. Анализ проводили после разделения пептидов на нанопотоковом хроматографе EASYnLC 1000 ("Thermo Scientific", США), в качестве детектора использовали масс-спектрометр высокого разрешения OrbiTrap Elite ("Thermo Scientific", США). Регистрацию панорамных спектров осуществляли в диапазоне от 500 до 2000 m/z с разрешением 240 000, фрагментацию ионов проводили в камере диссоциации высокого давления HCD, спектры фрагментации записывали при разрешении 60 000. Пептиды разделяли на капиллярной колонке (150 мм х 75 мкм) ("Phenomenex", США). Хроматографический анализ гидролизатов. Анализ гидролизатов осуществляли, используя хроматографическую систему высокого давления BREEZE ("Waters", США), на колонке Phenomenex Luna С18(2) (ЮОА, 5 мкм, 250x4.6 мм), уравновешенной 0.1%-ной трифторуксусной кислотой, в градиенте концентрации ацетонитрила (2 95% в течение 30 мин) при скорости элюции 1 мл/мин и температуре колонки 30 °С. На колонку наносили 20 мкл образца. Детекцию пептидов осуществляли при длине волны 215 нм. Продукты переработки масличных культур вызывают все возрастающий интерес в мире как источник доступных белков. В настоящее время в качестве глобального источника белка растительного происхождения для пищевой промышленности и кормопроизводства на первом месте стоит соя. Это обусловлено доступностью продуктов ее переработки и относительно высоким содержанием в них белков. Рапс входит в пятерку наиболее культивируемых в мире масличных культур, занимая пятое место после сои, хлопка, арахиса и подсолнечника. Поскольку рапс является более холодостойкой культурой по сравнению с ними, то при климатических условиях России он приобретает особое значение как источник растительного белка. Аминокислотный состав рапсовых и соевых белков хорошо сбалансирован и содержит достаточное количество серосодержащих аминокислот и лизина. Белки рапса получали из обезжиренного жмыха, по методике, описанной ранее. Она предусматривала получение белковых препаратов, не содержащих антипитательные вещества, присутствующие в жмыхе рапса. Белки из муки рапсового жмыха экстрагировали 0.5 М NaCl при рН 10.5 и концентрации муки не более 3% (вес/об.). Часть нежелательных компонентов удаляли при промывке муки 60%-ным этиловым спиртом. Экстрагирующиеся вместе с белками антипитательные низкомолекулярные соединения отделяли ультрафильтрацией экстрактов через мембраны с порами, пропускающими молекулы с молекулярной массой не более 10 кДа. Для удаления NaCl белки осаждали этиловым спиртом при соотношении 1:9 (об./ об.) и 4 °С, затем суспендировали в воде и высушивали лиофильно. По данным аминокислотного анализа содержание белка в полученных белковых препаратах составляло около 92%. При проведении реакции с хлоридом железа (III) не было обнаружено изменение окраски растворов белков, что свидетельствовало об отсутствии в них соединений фенола. Аминокислотный состав белковых препаратов и рыбной муки оказался сопоставимым, но они несколько различались по содержанию ряда аминокислот. Для гидролиза белков рапса и сои использовали коммерческий препарат протосубтилин. Поскольку по данным производителя в состав препарата входили поваренная соль, мел и кукурузная мука, то перед его использованием нерастворимый материал отделяли, раствор концентрировали и лиофильно высушивали. Комплексный ферментный препарат бактериального происхождения — протосубтилин содержит в качестве основного компонента протеолитический фермент субтилизин, продуцируемый бактерией Bacillus subtilis. Ферментативную активность препарата обеспечивает комплекс нейтральных и щелочных протеаз, а также сопутствующие минорные компоненты, включающие альфа-амилазу, бета-глюканазу, ксиланазу и целлюлазу. По данным производителя максимальную ферментативную активность протосубтилин проявляет при рН 4—6 и 40—60 °С. Поскольку в составе белков рапса содержатся глобулины (-70% общего белка) с pI в пределах 4—7, и альбумины с pI ~ 10, a pI белков сои — от 4.5 до 6.4, то для гидролиза был выбран рН 7.5 и комнатная температура, то есть условия, близкие к оптимальным, но обеспечивающие лучшую растворимость. Коммерческий белковый изолят сои и белки рапса (3 мг/мл) гидролизовали протосубтилином в указанных выше условиях при соотношении протосубтилин/белок 1/20 или 1/100 в течение 1, 4 и 20 ч. Предварительная денатурация белков не оказывала влияния на глубину гидролиза. Полученные гидролизаты анализировали методами электрофореза в ПААГ в присутствии ДДС-Na, ВЭЖХ и масс-спектрометри, а также определяли в них содержание свободных аминокислот.Основные белки рапса, глобулины, растворимы в солевых растворах. Глобулины (Мм~ ~300 кДа) состоят из 6 субъединиц, которые образуют четвертичную структуру. Полипептидные цепи субъединиц частично связаны между собой дисульфидными мостиками. Альбумины характеризуются низкой молекулярной массой (-12—14 кДа) и хорошо растворимы в воде. На рис. 1а приведена электрофореграмма гидролизатов белков рапса. Из рис. 1а видно, что как при соотношении протосубтилин/белок 1/20, так и 1/100 практически все высокомолекулярные белки гидролизовались полностью в течение 1 ч. При соотношении протосубтилин/белок 1:20 образовывались пептиды с молекулярной массой менее 14 кДа. При соотношении протосубтилин/белок 1:100 пептиды с молекулярной массой 10—14 кДа расщеплялись медленнее. В начальный период процесса гидролиза наблюдалось небольшое помутнение реакционной смеси. Можно предположить, что в это время образовывались большие пептидные фрагменты, имеющие изоэлектрическую точку около 7.5, которые затем расщеплялись в ходе дальнейшего гидролиза. В результате гидролизат белков рапса был, в основном, растворим при рН 7.5. Таким образом, в результате гидролиза протосубтилином белков рапса в течение 20 ч при соотношении фермент/белок 1:20 наблюдалось их полное расщепление и накопление низкомолекулярных олигопептидов с молекулярной массой ниже 14 кДа, которые составляли 53% от массы исходного белкового материала, и свободных аминокислот, доля которых была 8%. На рис. 2 а и б приведены хроматограммы гидролизатов белков рапса, полученных после гидролиза протосубти лином в течение 20 ч при различных соотноше ниях фермент/белок. Видно, что при соотношении 1:20 гидролиз исходного белкового материала проходил полнее, гидролизат был обогащен олиго пептидами меньшего размера по сравнению с гидролизатом, полученным при соотношении прото субтилин/белок 1:100. Таким образом, изменение соотношения фермент/белок (при прочих равных условиях) позволяло варьировать глубину гидролиза рапсовых белков. На рис. 3 приведены данные масс-спектрометрического анализа гидролизата белков рапса. На масс-хроматограмме (рис. 36) видно, что разброс молекулярных масс пептидов в гидролизате, в основном, находился в пределах 1.5—16 кДа. Аналогичные результаты были получены в работе при изучении гидролиза белков рапса зарубежными коммерческими ферментными препаратами Alcalase и Flavourzyme. Основным компонентом препарата Alcalase является серино вая протеаза, субтилизин A. Flavourzyme содержит эндо- и экзопротеазы, продуцируемые бактерией Aspergillus orizaye. Конечный гидролизатхарактеризовался степенью гидролиза 60% и был полностью растворим при рН между 2.5 и 7. Другой характер ферментолиза наблюдался при действии протосубтилина на коммерческий белковый изолят сои в тех же условиях, что и при гидролизе белков рапса (рН 7.5, комнатная температура, концентрация белка 3 мг/мл). В процессе гидролиза белков сои наблюдалось значительное помутнение реакционной смеси, не исчезавшее до его конца, которое, по-видимому, было связано с образованием нерастворимых белковых фрагментов. На рис. 1 б представлена электрофореграмма растворимой части соевого гидролизата. Отсутствие высокомолекулярных фрагментов могло свидетельствовать, как о глубине гидролиза, так и о том, что образующиеся в процессе ферментолиза крупные фрагменты белков формировали нерастворимую часть гидролизата. Растворимую часть гидролизата белкового изолята сои анализировали также методом ВЭЖХ (рис. 2 в, г). На представленных хроматограммах видно, что в составе растворимой части гидролизата отсутствовали, как крупные пептидные фрагменты, так и исходный белок. Суммарная площадь пептидных пиков оказалась значительно меньше, чем в случае гидролизата белков рапса. По результатам аминокислотного анализа растворимая часть гидролизата содержала короткие олигопептиды и свободные аминокислоты, составляющие в сумме только 13% от исходного белкового материала. На рис. 4 приведены данные масс-спектрометрического анализа растворимой части гидролизата белков сои. На масс-хроматограмме (рис. 4 б) видно, что разброс масс пептидов в гидролизате, в основном, составлял 1.5—12 кДа. В то же время в гидролизате присутствуют и высокомолекулярные белковые фрагменты. Основными белками соевых бобов являются глобулины — глицинии и бета-конглицинин в соотношении 75/115, составляющие 80% от белкового материала сои. Оба белка имеют сложную четвертичную структуру. При этом глицинии состоит из 5 субъединиц и имеет коэффициент седиментации 11S, а бета-конглицинин (коэффициент седиментации 7S) состоит из 3 субъединиц (76, 72 и 53 кДа). Кроме глобулинов, нерастворимых в воде, но растворимых в растворах нейтральных солей, в сое содержатся водорастворимые белки, характеризующиеся более низкой молекулярной массой. К ним относятся минорныйу-конглицинин и относительно небольшое количество других белков, включая "сывороточные белки", в сумме составляющие от 9 до 15% массы белков сои. Обладая сложной четвертичной структурой, которая формируется крупными полипептидами, глобулины сои в определенных условиях быстро денатурируют с разворачиванием полипептидных цепей, а последующая агрегация индуцирует их желирование. Агрегация белков провоцируется нагреванием, замораживанием, закислением среды, высоким давлением и ферментами. Скорость желирования зависит от концентрации белка в растворе. Несмотря на то, что процессы желирования таких линейных молекул, как полисахариды и фибриллярные белки, хорошо изучен, процесс желирования глобулярных белков мало понятен из-за их сложного строения. Коагуляцию соевых белков при ферментолизе наблюдали и другие исследователи. В работе при использовании для гидролиза соевых белков субтилизина Carlsberg (CS) наблюдали коагуляцию полипептидов при степени гидролиза 10%, при рН ~7.5 — при степени гидролиза 5%. Интенсивное желирование фрагментов соевых белков наблюдали также при использовании ферментных препаратов Novozym FM 2.0 L и Alcalase 2.4 L, основной компонент в которых субтилизин. Изменение ионной силы среды (0.03, 0.2 и 0.5 М) оказывало незначительное влияние на рН агрегации. Это свидетельствовало о том, что агрегация связана не только с установлением баланса между электростатическими и гидрофобными взаимодействиями, а представляет намного более сложный процесс. Электрофорез в ПААГ в присутствии ДДС-Na показал, что все ферментные препараты деградировали бета-конглицинин и глицинии. Однако основной компонент глицинина обладал высокой устойчивостью к действию перечисленных выше ферментных препаратов. На основании результатов целого ряда работ по ферментативному гидролизу соевых белков был сделан вывод, что белки сои вследствие компактной четвертичной и третичной структуры малодоступны для ферментативного гидролиза, так как многие их участки закрыты и труднодоступны для ферментов. Таким образом, разработаны условия ферментолиза белков рапса отечественным коммерческим ферментным препаратом протосубтилин. Полученный гидролизат не содержал антипитательных соединений, глубина гидролиза была показананесколькими методами. Содержание в гидролизатах свободных аминокислот и олигопептидов с молекулярной массой ниже 10 кДа, а также фрагментов белков с более высокой молекулярной массой зависело от условий гидролиза. При соотношении протосубтилин/белок 1:20 и времени гидролиза 20 ч в гидролизате рапсовых белков содержание свободных аминокислот и олигопептидов с молекулярной массой ниже 14 кДа составляло 8 и 53% от исходного белкового материала соответственно. Одна из главных проблем протеолитического гидролиза соевых белков связана с образованием нерастворимых фрагментов и их коагуляцией. В настоящей работе показано, что при гидролизе коммерческого белкового изолята сои протосубтилином наблюдалась значительная коагуляция продуктов с образованием нерастворимого осадка, что значительно снижало выход растворимых продуктов гидролиза. При соотношении протосубтилин/ белок 1:20 и времени гидролиза 20 ч содержание свободных аминокислот в растворимой части гидролизата соевых белков составляло всего 2.4% от исходного белкового материала, а олигопептидов с молекулярной массой ниже 14 кДа — 10.4%. При этом общий выход растворимого пептидного материала составлял только 12.8%.

Авторы:

Издание: Прикладная биохимия и микробиология
Год издания: 2018
Объем: 9с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.277-285. Библ. 36 назв.
Просмотров: 1007