ДЕЙСТВИЕ 20-ГИДРОКСИ-(5Z,8Z,llZ,14Z)-ЭЙКO3ATETPAEHOBOЙ И АРАХИДОНОВОЙ КИСЛОТ НА ДИФФЕРЕНЦИРОВКУ Neurospora crassa

Аннотация:

Сравнительный анализ действия арахидоновой кислоты и ее производных — 3-гидрокси(5Z,8Z,llZ,14Z)-эйкозатетраеновой (3-НЕТЕ) и 20-гидрокси-(5Z,8Z,llZ,14Z)-эйкозатетраеновой (20-НЕТЕ) кислот, на образование половых и бесполых структур у Neurospora crassa свидетельствует о том, что наличие и положение гидроксильной группы в ненасыщенной жирной кислоте важно для проявления биологического действия соединения. Под действием 3-НЕТЕ, 20-НЕТЕ и арахидоновой кислоты, взятых в концентрации 5 мкМ, уменьшалось образование вегетативных спор на свету на 45, 31 и 40% соответственно, что свидетельствовало о сходном механизме их действия на светозависимое бесполое размножение гриба. Вместе с тем, действие данных соединений на половой процесс N. crassa кардинально отличается. Методом ГХ— МС в клетках N. crassa было показано 4-кратное увеличение количества мононенасыщенной олеиновой кислоты после добавления в среду арахидоновой кислоты при отсутствии эффекта 20-НЕТЕ. Наряду с этим, в мицелии гриба возрастало содержание линолевой кислоты, в большей степени при внесении 20-НЕТЕ. Оксилипины — оксигенированные производные полиненасыщенных жирных кислот найдены у различных представителей растений, животных и микроорганизмов. Их синтез может быть как ферментативным, так и неэнзиматическим, с участием активных форм кислорода. Функции оксилипинов разнообразны: они являются молекулами, регулирующими процессы развития и формирование ответов на внешние воздействия. В частности, у грибов они ответственны за межклеточные взаимодействия, биосинтез вторичных метаболитов, включая микотоксины и антибиотики, а также за взаимоотношения паразит-хозяин у патогенных видов. Кроме того, оксилипины как коммуникативные молекулы участвуют во внутривидовых и межвидовых взаимоотношениях. За последние несколько лет накоплено много фактов об их физиологической роли и путях биосинтеза у грибов. Оксилипины контролируют развитие, а именно ход бесполого и полового циклов у целого ряда грибов, таких как Aspergillus nidulans, Aspergillus flavus, Aspergillus parasiticus, Septoria fructicola и Neurospora crassa. Ранее было изучено влияние следующих оксилипинов3 (R)- гидрокси - (5Z, 8Z, 11Z, 14Z) -эйкозатетраеновой кислоты (3-НЕТЕ) и 18-гидрокси-(9Z,12Z)-октадекадиеновой кислоты (18-HODE), на рост и агрегацию гиф, а также на ряд светозависимых процессов, биосинтез каротиноидов, половое и бесполое воспроизведение у N. crassa. Кроме того, было исследовано действие оксигенированных производных линолевой и линоленовой кислот, 18-HODE и 18-гидpoкcи-(9Z,12Z,15Z)-oктaдeкaтpиeнoвoй кислоты (18-НОТrЕ), на образование конидий и протоперитециев у дикого типа и мутантов по фоторецепторному комплексу этого гриба. Интерес к изучению действия оксилипинового производного арахидоновой кислоты, 20-гидpoкcи-(5Z,8Z,llZ,14Z)-эйкoзaтeтpaeнoвoй кислоты (20-НЕТЕ), связан с возможнымиспользованием этого соединения в медицине. Известно, что 20-НЕТЕ оказывает влияние на протекание таких заболеваний, как гипертония, рак, заболевания почек и сосудов. Низкие концентрации этого соединения обнаруживают in vivo. После инъекции 20-НЕТЕ крысам отмечено резкое снижение пороговых значений боли, определяемых ноцицептивным анализом в ответ на механическое раздражение, в то же время этого не происходило при использовании 20-гидроксиэйкозапентаеновой или 22-гидроксидокозагексаеновой кислот. Данные о действии 20-НЕТЕ на грибы в литературе отсутствуют. Объектом для исследований был выбран аскомицет N. crassa, широко применяемый в качестве модельного организма в генетике, биохимии и молекулярной биологии. Этот гриб легко культивируется на средах, цикл развития занимает 1—2 недели. Смена морфологически четко различимых фаз развития индуцируется изменением факторов среды, среди которых одним из наиболее важных является свет. Свет влияет на целый ряд физиологических процессов у N. crassa, в числе которых биосинтез каротиноидов, сдвиг циркадных ритмов образования конидий, направление выбрасывания аскоспор, электрогенез клеточных мембран, активность и молекулярная организация некоторых ферментов. В поверхностной культуре аскомицета синий свет стимулирует образование вегетативных спор, конидий, в условиях голодания по углероду и формирование предшественников женских половых структур, протоперитециев, в условиях голодания по азоту. Чувствительность гриба к световой экспозиции зависит также от источника азота в среде для выращивания. Конидиогенез в клетках N. crassa, выращенных на среде с NH4C1 в качестве единственного источника азота, нечувствителен к свету, в то время как освещение культуры, выращенной на среде с NH4N03 или NaN03, стимулирует процесс образования спор. Цель работы — синтез 20-НЕТЕ и тестирование ее действия на светозависимое половое и бесполое размножение N. crassa, сравнение полученных результатов с аналогичными данными для арахидоновой кислоты и 3-НЕТЕ. Синтез 20-НЕТЕ. 20-гидрокси-(5Z,8Д11Z,14Z)эйкозатетраеновая кислота была получена химическим синтезом через ацетиленовый предшественник с последующим каталитическим гидрированием и применением палладиевого катализатора как описано в работах. Ацетиленовый предшественник полиеновой жирной кислоты с бензоил-защищенной гидроксильной группой по со-положению был синтезирован на основе разработанного метода синтеза с применением медьорганических реагентов в ключевой реакции кросс-сочетания галогенида пропаргильного типа с терминальной ацетиленовой компонентой. Получена характеристика целевого соединения 20-НЕТЕ методами ВЭЖХ, 1Н ЯМР, 13С ЯМР. 1) Аналитическую ВЭЖХ осуществляли в обращенной фазе на жидкостном хроматографе Shimadzu ("Shimadzu", Япония), снабженным SPD-10Advp UV/Vis-детектором и насосной системой LC-10Avp, колонкой Nucleosil С18, 250 х 4 мм, с размером частиц 5 мкм ("Macherey-Nagel", Германия), R, 6.10 мин., элюент— метанол: вода:уксусная кислота (85: 15:0.1, об./об.), скорость потока 1 мл/мин. 2) Условия проведения 'Н ЯМР-спектроскопии: спектрометр Brucker MSL (США) 300 МГц в CDC13 с тетраметилсиланом в качестве внутреннего стандарта (300 МГц, CDC13) 5 м.д.: 5.25-5.41 (м, 8Н, СН=СН), 3.62 (т, 2Н, J= 6.41 Гц, СН2ОН), 2.682.89 (м, 6Н, 7-, Ю- и 13-СН2), 2.31 (т, 2Н, J 7.5 Гц, 2-СН2), 1.98-2.13 (м, 4Н, 16 и 4-СН2), 1.46-1.71 (м, 4Н, 3- и 19-СН2), 1.26-1.42 (м, 4Н, 17- и 18-СН2). 3) Условия проведения 13С ЯМР-спектроскопии: спектрометр Brucker MSL (США) 300 МГц в CDC13 относительно сигналов дейтерия в CDC13 (50 МГц, CDC13) 8 м.д.: 178.26, 130.26, 129.19, 129.01, 128.68, 128.38 (2С), 128.17, 128.09, 63.04, 33.52, 32.68, 29.55, 27.35, 26.72, 25.84 (ЗС), 25.58, 24.81.Микроорганизм, условия культивирования и обработки мицелия гриба арахидоновой кислотой и 20-НЕТЕ. В работе использовали штамм 987 дикого типа N. crassa, любезно предоставленный Центром по хранению генетического материала грибов (Fungal Genetics Stock Center — FGSC, Канзас Сити, США). Получение конидий, используемых в качестве посевного материала, проводили, как описано в предыдущей работе. Суспензию спор концентрацией 30 мг/мл хранили при —70 °С. Бесполое и половое размножение N. crassa, а также добавление арахидоновой кислоты и 20-НЕТЕ к культурам гриба проводили согласно методике, разработанной ранее. Полученные результаты оценивали по числу конидий и протоперитециев, образовавшихся на 1 см2 поверхностной культуры в темноте или после экспозиции на свету в контрольных и обработанных тестируемыми соединениями культурах. При постановке экспериментов использовали от 3 до 10 биологических повторностей. Статистическую обработку осуществляли с помощью пакета MS Excel 2000. Определение поглощения арахидоновой кислоты культурой N. crassa. Конидии N. crassa вносили в виде суспензии из расчета 15 мг на колбу со 150 мл среды Фогеля. Культивирование проводили на качалке при 150 об/мин и температуре 28 °С. Через 22 ч (конец экспоненциальной фазы роста) в колбы добавляли исследуемый жирнокислотный субстрат до конечной концентрации 20 мкМ. После добавления одну колбу сразу же снимали с качалки (0 ч), следующую после 1 ч инкубации и последнюю еще через 1 ч (2 ч). Культуральную жидкость (КЖ) собирали после фильтрования через марлю и подкисляли 2 М НС1 до рН 3.5. Затем проводили экстракцию этилацетатом трижды в делительной воронке, добавляя растворитель в соотношении 1:2 этил ацетат—КЖ. Экстракт упаривали досуха на вакуумном испарителе ("Buchi", Швейцария) при давлении 1 мм рт. ст. Количественный ВЭЖХ-анализ арахидоновой кислоты в образцах КЖ проводили на жидкостном хроматографе Shimadzu (Япония), снабженном SPD-10 Advp UV-детектором и насосной системой LC-10Avp на обращенно-фазовой колонке Nucleosil С18, 250 х 4 мм, с размером частиц 5 мкм ("Macherey-Nagel", Германия), с использованием изократического элюента ацетонитрил: метанол (60:40 об./об.) при скорости потока 1 мл/мин. Для приготовления образцов метилового эфира арахидоновой кислоты с целью построения градуировочной кривой использовали стандарт арахидоновой кислоты 99,8% чистоты ("Sigma-Aldrich", США), который разбавляли метанолом для достижения необходимой концентрации. Обработку данных ВЭЖХ-анализа проводили в программе "Unichrom" (Беларусь). Определение эндогенного жирнокислотного состава культуры N. crassa до и после обработки арахидоновой кислотой и 20-НЕТЕ. В 4 колбы (1 контроль, 3 опытных), со 150 мл культуральной среды Фогеля, вносили конидиальную суспензию N. crassa из расчета 15 мг на колбу. Культивирование проводили на качалке при 150 об./мин и температуре 28 °С. Через 22 ч выращивания в опытные колбы добавляли исследуемый жирнокислотный субстрат до конечной концентрации 20 мкМ и инкубировали в тех же условиях еще 2 ч. Биомассу отфильтровывали на воронке Бюхнера через несколько слоев марли. Мицелий промывали 50 мл 0.05 М трис-HCl буфера, рН 7.5, отжимали, взвешивали и разрушали растиранием в ступке с жидким азотом в течение 15 мин. В соответствии с полученной массой добавляли этиловый спирт до конечной концентрации 80% и подкисляли суспензию, добавляя 2 М НС1 до рН 3.5. Смесь оставляли в холодильнике на 20 ч. Затем спиртовую суспензию центрифугировали при 20 000 g в течение 30 мин и супернатант сливали. Осадок промывали 10 мл этилового спирта и снова центрифугировали при тех же условиях. Супернатанты объединяли, полученные пробы подкисляли до рН 3.5 и экстрагировали трехкратно по 15 мл этилового спирта. Полученные экстракты упаривали и растворяли в 100 мкл хлороформа. Затем при помощи препаративной ТСХ на пластинах силикагеля 20 х 20 см, 500 мкм ("Merck", Германия) проводили разделение в смеси диэтиловый эфир:гексан:уксусная кислота (50:50:0.1, об./об.). В качестве свидетелей применяли арахидоновую кислоту, 3-НЕТЕ [191 и 18-НЕТЕ, синтезированные нами ранее. Пластины со свидетелями проявляли в парах йода. С непроявленных пластин собирали зоны, соответствующие Rf свидетелей, а также расположенные ниже на пластине, характерные для более полярных производных жирных кислот, суспендировали в смеси хлороформ: этанол (2:1, об./об.), фильтровали на стеклянном фильтре № 4 ("Duran", Германия), который промывали смесью хлороформ: этанол (8:1, об./об.), затем фильтраты упаривали. Присутствие соединений контролировали с помощью ТСХ в системе гексан: этилацетат 4:1 (об./об.). Далее проводили метилирование образцов при помощи диазометана в токе аргона, присутствие образованных эфиров проверяли при помощи ТСХ в системе гексан: этилацетат 1:1 (об./об.). Затем образцы упаривали досуха на вакуумном испарителе ("Buchi", Швейцария) при давлении 1 мм рт. ст. Вещества переносили в стеклянные пробирки с 600 мкл метилового спирта, заполняли аргоном и хранили при —20 °С. Анализ образцов экстрактов культуры проводили с помощью ГХ—МС на газовом хроматографе с масс-спектрометрической детекцией Shimadzu GCMS-QP2010 SE (Япония) с использованием капиллярной колонки SLB-IL82 (30 м х 0.25 мм х 0.2 мм, "Supelco", США), применяя линейный градиент температур от 120 до 260 °С с шагом 5 °С/мин и 2 мин изотерму Ттах 270 °С. В качестве стандартов использовали полученные нами метиловые эфиры арахидоновой кислоты и 20-НЕТЕ, 98—99% чистоты (поданным ВЭЖХ), в пробе 1—2 мкг/мл. Влияние 20-НЕТЕ и арахидоновой кислоты на образование бесполых спор у N. crassa. Добавление 20-НЕТЕ к темновым культурам гриба практически не сказывалось на формировании конидий по сравнению с контролем без добавления этого соединения (рис. 2). Аналогичный результат был получен и для арахидоновой кислоты (табл. 1). Световая экспозиция N. crassa в присутствии 5 и 10 мкМ 20-НЕТЕ приводила к уменьшению образования конидий (рис. 2), однако при увеличении концентрации 20-НЕТЕ до 20 мкМ количество бесполых спор в освещенных культурах было сравнимо с таковыми в контроле. Необычный эффект отмечен в присутствии 5 мкМ арахидоновой кислоты, в этом варианте активирующее действие света на конидиогенез не проявлялось (табл. 1). Сравнение результатов данной работы с полученными ранее |4| показало уменьшение образования вегетативных спор на свету под действием 3-НЕТЕ, 20-НЕТЕ и арахидоновой кислоты, взятых в концентрации 5 мкМ, на 45, 31 и 40% соответственно, что свидетельствовало о сходном механизме их действия на светозависимое бесполое размножение гриба. Известно, что фотозависимые процессы у N. crassa регулируются гетеродимерным белковым комплексом WCC (white collar complex), который воспринимает сигнал света с помощью кофактора ФАД, связанного с LOV-доменом апобелка WC-1. WCC присоединяется к промоторам светорегулируемых генов, активируя их экспрессию. Ранее нами было показано, что оксилипины 18-HODE и 18-НОТrЕ не влияли на образование протоперитециев у мутантов N. crassa по фоторецепторному комплексу (в отличие от дикого типа гриба), что, по-видимому, свидетельствовало о его участии в передаче сигнала. Стимуляция образования конидий у мутанта wc-1 под влиянием исследованных оксилипинов и отсутствие их действия на штамме wc-2 может указывать на наличие альтернативных путей передачи сигнала оксилипинов при конидиогенезе. Под контролем света и оксилипинов находятся процессы дифференцировки и у других грибов. Наиболее изученными в этом отношении являются различные виды рода Aspergillus. Показано, что спорогенный эффект света и производных линолевой кислоты требует присутствия интактного гена veA. Регуляторы морфогенеза у Aspergillus nidulans представляют собой оксилипиновые гормоны, psi-факторы (precocious sexual inducers), действие которых сходно с таковым простагландиновых гормонов у млекопитающих и жасмонатов у растений. Предполагают, что оксилипины быстро метаболизируются в клетках грибов и синтезируются de novo из различных полиненасыщенных жирных кислот под действием определенных внешних или внутренних сигналов. Бейрэм с соавт. сравнили транскрипционные и метаболитные профили A. nidulans в циклах развития в темноте и при освещении. Под действием света у данного гриба ускорялось образование вегетативных спор и уменьшалось формирование половых структур. При этом освещение приводило к изменению экспрессии пятой части генома, а в темноте наблюдали резкое увеличение синтеза psi-факторов, индуцирующих половое развитие.Предполагают, что оксилипины контролируют баланс полового и бесполого спорообразования у грибов. Влияние 20-НЕТЕ и арахидоновой кислоты на половой процесс N. crassa. Изучено действие 20-НЕТЕ и арахидоновой кислоты в пределах концентраций 5—50 мкМ на образование предшественников женских половых структур аскомицета, протоперитециев. По сравнению с необработанными оксилипином контролями, для 20-НЕТЕ эффективной оказалась только концентрация 10 мкМ, при которой наблюдалась активация образования структур в темноте и ингибирование процесса на свету. Последующее увеличение концентрации соединения привело к нивелированию влияния как при темновой, так и световой экспозиции (рис. За). В противоположность этому, при увеличении концентрации арахидоновой кислоты происходила равномерная стимуляция формирования протоперитециев как в темновых, так и в подвергнутых освещению культурах N. crassa (рис. 36). Исключение составлял темновой вариант, обработанный 50 мкМ арахидоновой кислоты. Сходный эффект активирующего действия оксилипина на образование протоперитециев при темновой инкубации показан ранее для 3-НЕТЕ. Максимальный ответ был получен при концентрации 20 мкМ для обоих соединений, причем стимуляция у темновых культур составила 57% для арахидоновой кислоты и 135% для 3-НЕТЕ. Таким образом, действие оксилипиновых производных арахидоновой кислоты, отличающихся положением гидроксильной группы, на половой процесс N. crassa кардинально различается. В последнее время предпринимаются попытки применить метаболомный подход для оценки влияния арахидоновой кислоты на процессы, происходящие в клетках грибов. Так, китайские исследователи использовали этот метод в сочетании с мультивариантным анализом, чтобы определить биохимические изменения у зигомицега Blakeslea trispora при увеличении продукции бета-каротина, наблюдаемом после обработки арахидоновой кислотой. Авторы показали, что внесение арахидоновой кислоты приводило к ускорению процессов гликолиза, увеличению уровня некоторых жирных кислот и уменьшению концентрации аминокислот. Способность мицелия N. crassa поглощать арахидоновую кислоту из среды культивирования. При помощи ВЭЖХ определяли способность культуры N. crassa поглощать ненасыщенные жирнокислотные субстраты из культуральной среды. На рис. 4 представлены хроматограммы детектирования арахидоновой кислоты в ьсультуральной жидкости гриба при различном времени культивирования N. crassa с субстратом. Показано, что арахидоновая кислота выявляется как в нулевой точке, так и после 1 ч культивирования, однако она полностью усваивается N. crassa за 2 ч. При этом в контроле "среда + + арахидоновая кислота" концентрация арахидоновой кислоты за 2 ч инкубации снижалась очень незначительно. Определение жирнокислотного состава клеток N. crassa и его изменение под воздействием арахидоновой кислоты и 20-НЕТЕ. Методом ГХ-МС были определены изменения в составе жирных кислот (в % от суммы), экстрагированных из мицелия N. crassa, при добавлении жирнокислотных субстратов в среду культивирования (табл. 2). Линолевая кислота преобладала в составе жирных кислот в мицелии гриба, что согласовывалось с данными спектрального анализа, полученными Нукина с соавт. Добавление этой кислоты к культурам N. crassa приводило к 20-кратномуувеличению образования перитециев, что свидетельствовало о важной роли ненасыщенных жирных кислот в половом процессе в отличие от насыщенных. После инкубации с жирнокислотными субстратами содержание линолевой кислоты в мицелии гриба возрастало, что особенно заметно в случае внесения 20-НЕТЕ. Характерно, что уровень содержания линоленовой кислоты при этом практически не изменялся. Количество другой ненасыщенной жирной кислоты — олеиновой, выросло в 4 раза после добавления в среду арахидоновой кислоты, тогда как при добавлении 20-НЕТЕ такого не наблюдалось. Необходимо отметить также факт отсутствия пальмитоеновой кислоты в контроле и ее появление после инкубации с жирнокислотными субстратами. Таким образом, после инкубации с арахидоновой кислотой и 20-НЕТЕ в клетках N. crassa возрастало количество жирных кислот в основном ненасыщенных с более короткой цепью. Известно, что синтез оксилипинов зависит от действия факторов внешней среды и стадий развития организма и является важным путем образования соединений с регуляторными свойствами, обеспечивающими адаптацию гриба к конкретным условиям существования. В предыдущих наших работах были показаны ответы в изменении жизненных циклов N. crassa при добавлении к культуре различных оксигенированных производных полиненасыщенных жирных кислот. В отличие от 18-НОТrЕ, оксилипины 3-НЕТЕ и 18-HODE вызывали увеличение образования протоперитециев в темноте. Оксилипины по-разному влияли на бесполое размножение гриба: 3-НЕТЕ стимулировала образование конидий в темноте, I8-HODE- на свету, а 18-НОТrЕ ингибировала конидиогенез в освещаемых культурах. Сравнительный анализ действия арахидоновой кислоты и ее производных, 3-НЕТЕ и 20-НЕТЕ, на образование половых и бесполых структур у N. crassa свидетельствовал о важности наличия и положения гидроксильной группы в ненасыщенной жирной кислоте для проявления биологического действия соединения.

Авторы:

Издание: Прикладная биохимия и микробиология
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.286-293. Библ. 29 назв.
Просмотров: 103