МОДЕЛИ ПОДКОЖНОГО И ОРТОТОПИЧЕСКОГО КСЕНОГРАФТОВ РАКА МОЧЕВОГО ПУЗЫРЯ ЧЕЛОВЕКА У МЫШЕЙ NUDE ДЛЯ ИССЛЕДОВАНИЯ ВОЗДЕЙСТВИЙ, НАЦЕЛЕННЫХ НА РЕЦЕПТОР ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА

Аннотация:

Подходы, основанные на принципах таргетной терапии, рассматриваются как перспективное направление создания новых методов лечения, способных увеличить эффективность лечения больных раком мочевого пузыря (РМП). Цель исследования — получение ортотопической модели РМП человека у мышей линии nude и обоснование ее пригодности для экспериментального изучения таргетных препаратов, нацеленных на рецептор эпидермального фактора роста (РЭФР). Объектом исследования служили эктопические подкожные и ортотопические ксенографты РМП человека, полученные с использованием культивируемых клеток линий EJ и 5637. Рост ортотопических ксенографтов in vivo оценивали методом магнитно-резонансной томографии. Для исследования тканей опухолей использованы методы гистологического и иммуногистохимического анализа. В результате показано, что как эктопические, так и ортотопические ксенографты EJ и 5637характеризуются высокой воспроизводимостью модели, хорошим кровоснабжением ткани, высоким уровнем экспрессии РЭФР и отличаются локализацией рецептора в опухолевых клетках. Пролиферация клеток EJ и 5637 в слизистой оболочке мочевого пузыря мышей при их внутрипузырной имплантации преимущественно приводит к образованию мышечно-неивазивной формы опухоли. Заключение. Ксенографты EJ и 5637у иммунодефицитных мышей могут быть использованы в качестве моделей РМП человека для изучения эффективности биотерапевтических воздействий, использующих в качестве мишени РЭФР. Рак мочевого пузыря (РМП) — одна из наиболее часто встречающихся злокачественных опухолей. РМП характеризуется высокими темпами годового прироста заболеваемости и занимает одно из ведущих мест в структуре онкологической смертности в развитых странах мира, в том числе в России. Высокий риск рецидива опухоли после органосохраняющего лечения, а также ограниченные возможности радикального лечения при местнораспространенных формах РМП делают данное заболевание актуальной проблемой современной онкоурологии. Прогресс на пути улучшения отдаленных результатов лечения больных злокачественными новообразованиями связывают с таргетными методами лечения. Привлекательной мишенью для разработки различных вариантов таргетной терапии при РМП являются мембранные белки семейства рецепторов эпидермального фактора роста (РЭФР, ErbB). Высокая экспрессия РЭФР (ErbBl) в клетках первичного РМП, по данным клинико-морфологических исследований, наблюдается в 74—86 % случаев, коррелирует с глубокой инвазией, низкой степенью дифференцировки и высокой пролиферативной активностью опухоли. Адъювантное применение при распространенных формах РМП моноклональных антител к РЭФР (цетуксимаб) или ингибиторов тирозинкиназы (гефитиниб, лапатиниб) не показало ожидаемой клинической эффективности. Это стимулирует поиск причин резистентности РМП к данным видам терапии и путей ее преодоления, поиск новых препаратов и схем комбинированного лечения, а также разработку способов направленной доставки к клеткам РМ П цитостатиков, фотосенсибилизаторов, диагностических и терапевтических радионуклидов с использованием РЭФР в качестве мишени. Экспериментальные исследования in vivo чаще всего выполняются на моделях эктопических трансплантатов РМП человека, полученных подкожной инокуляцией культивируемых опухолевых клеток или имплантацией операционного материала иммунодефицитным мышам. С учетом механизма противоопухолевого действия релевантность модели для оценки активности ингибиторов РЭФР-ассоциированных тирозинкиназ, как правило, подтверждают определением содержания рецептора в клетках методом вестерн-блота, для тестирования воздействий на основе антител к РЭФР — дополняют характеристику модели иммуногистохимическим исследованием внутриклеточного распределения рецептора. Исследования РЭФР-направленных воздействий на ортотопических моделях ксенографтов РМП человека немногочисленны, хотя известно, что такая модель позволяет в большей степени воспроизвести особенности микроокружения опухоли, которые могут влиять как на экспрессию молекулярной мишени, так и на ответ опухоли на воздействие. Опубликованные работы с использованием такой модели либо не содержат удовлетворительной характеристики гистологических особенностей ксенографтов, либо представленные в них данные недостаточно информативны в отношении характера экспрессии рецептоpa-мишени в опухолевых клетках. Целью настоящей работы стало получение модели ортотопического ксенографта РМП человека и обоснование ее пригодности для экспериментального и доклинического изучения препаратов, нацеленных на опухолевые клетки с высокой экспрессией РЭФР. В работе использованы клеточные линии карциномы мочевого пузыря человека EJ и 5637 (любезно предоставлены профессором А.С. Соболевым, лаборатория молекулярной генетики внутриклеточного транспорта Института биологии гена РАН, Москва). Клетки культивировали во флаконах с площадью поверхности 25 или 75 см2 (Costar, США) на среде DMEM (для культуры EJ) или RPMI-1640 (для культуры 5637) с добавлением 2 mМ L-глютамина и 10 % эмбриональной телячьей сыворотки. Среды и культуральные добавки получены от компании «ПанЭко» (Россия). Мыши линии BALB/c пи/пи (nude), самки с массой тела 19-21 г (возраст 7-8 нед), получены из НПП «Питомник лабораторных животных» — филиала ФГБУН «Институт биоорганической химии им. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова» РАН. Животных содержали в специализированном помещении вивария, в условиях повышенной температуры и влажности. Уход за животными, все экспериментальные процедуры и манипуляции выполнялись в соответствии с правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных. Для имплантации мышам использовали клеточные линии, прошедшие от 3 до 7 пассажей культивирования. Клетки снимали с поверхности культуральных флаконов раствором Версена, отмывали в среде, не содержащей эмбриональную телячью сыворотку, подсчитывали количество жизнеспособных клеток в камере Горяева и на той же среде готовили клеточную суспензию для введения животным. На этапе подбора количества вводимых клеток экспериментальные группы состояли из 4 мышей,на этапе характеристики роста ксенографтов - из 5-8 мышей. Для получения подкожного ксенографта суспензию опухолевых клеток в количестве 1 х 106, 3 х 106 или 5 х 106 инокулировали мышам подкожно на правый бок в объеме 0,1 мл. Объем опухоли рассчитывали по формуле V= d1 х d22 х 0,52, где d1 и d2 - 2 взаимно перпендикулярных размера опухоли. Перед процедурой внутрипузырной инсталляции мышей анестезировали интраперитонеальным введением золазепама гидрохлорида («Золетил 100», 20 мг/кг) и ксилозина гидрохлорида («Ксилазин», 15 мг/кг) за 5 мин до начала манипуляций и фиксировали на препаровальном столике. Слизистую оболочку мочевого пузыря подвергали химическому повреждению по методике [28] путем введения через стерильный катетер, установленный в мочеиспускательный канал, 0,1 М раствора соляной кислоты с последующей его нейтрализацией 0,1 М раствора гидроксида натрия. После промывания полости мочевого пузыря стерильным физиологическим раствором в мочевой пузырь вводили 70 мкл суспензии, содержащей 1 х 106, 3 х 106 или 5 х 106 опухолевых клеток. В течение I ч мышей время от времени переворачивали, а при признаках выхода из наркоза — освобождали от фиксации. Осмотр, оценку общего состояния и взвешивание животных после процедуры проводили ежедневно. Снижение массы тела мышей более чем на 20 % от исходного показателя служило показанием для выведения животных из опыта. Эвтаназию животных проводили парами эфира. Исследование проводилось на базе Российского национального исследовательского медицинского университета им. Н.И. Пирогова (ЦКП «Медицинские и биотехнологические нанотехнологии»). Исследование выполнялось на магнитно-резонансном томографе ClinScan 7Т 70/30 (Bruker Biospin, Германия) с постоянным магнитным полем 7 Тл (градиентная система BGA 12S/20) при газовой анестезии животных. Обработка результатов проводилась с использованием программного обеспечения SyngoMR 15. Образцы тканей, полученные при аутопсии животных, фиксировали в нейтральном забуференном 10 % формалине и после стандартной гистологической проводки заключали в парафин. Готовили серийные срезы тканей толщиной 4 мкм. Для гистологического анализа срезы окрашивали гематоксилином и эозином (Г&Э). Для выявления экспрессии РЭФР в опухолевых клетках использовали моноклональное кроличье антитело D38B1 (Cell Signaling Technology, СА), для выявления клеток эндотелия - моноклональное крысиное антитело к CD34 мыши (BD Pharmigen™). Срезы окрашивали с использованием общепринятой техники непрямого иммунопероксидазного анализа. Для демаскировки антигена стекла с депарафинизированными срезами выдерживали в 0,1 М натрий-цитратном буфере (рН 6,0) при 95 °С в течение 20 мин. Система вторичных реагентов включала биотинилированные поликлональные антитела к иммуноглобулинам соответствующей видоспецифичности (Santa Cruz Biotechnology, Inc.), конъюгат стрептавидина с пероксидазой конского хрена (Dako) и хромогенный субстрат Liquid DAB + Substrate Chromogen System (Dako). На контрольные срезы вместо первичных антител наносили неспецифические иммуноглобулины кролика или крысы (Santa Cruz Biotechnology, Inc.). После завершения реакции клетки и срезы докрашивали гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Микропрепараты анализировали под микроскопом Olympus ВХ51 (Olympus Optical Со, Япония), оснащенным системой документирования изображений. На 1-м этапе выполнена оценка способности клеток EJ и 5637 к росту in vivo при подкожной инокуляции бестимусным мышам и исследована экспрессия РЭФР в клетках подкожных ксенографтов. Скорость пролиферации клеток EJ, 5637 при культивировании in vitro была сходной (по результатам МТТ-теста, данные не представлены), однако при подкожной инокуляции мышам nude клетки 5637 отличались более агрессивным биологическим поведением. Так, 100 % выход опухолей, т. е. образование подкожных ксенографтов у всех мышей в экспериментальной группе, при использовании клеток линии EJ достигался при инокуляции животным опухолевого материала в количестве не менее 3 х 106 клеток, образование подкожных ксенографтов при использовании клетоклинии 5637 — в количестве 1 х 106 клеток и более. Скорость увеличения объема опухоли 5637 значительно опережала скорость роста опухоли EJ. Через 21 день после инокуляции клеток EJ в количестве 3 х 106 размер подкожных образований варьировал от 100 до 250 мм3, при инокуляции того же количества клеток 5637 - от 220 до 450 мм3 (рис. 1).По результатам гистологического исследования подкожные ксенографты опухолей EJ и 5637 имели солидное строение, морфологически соответствующее низкодифференцированному новообразованию. В ткани обеих опухолей определялось большое количество митозов. Опухоли EJ отличались плеоморфными клетками, тесно расположенными в тонкой хаотичной стромальной сети (рис. 2а). Клетки опухоли 5637 были более мономорфны и образовывали разделенные прослойками соединительной ткани островки, которые особенно четко прослеживались по периферии роста опухолей (рис. 26). На 21-й деньроста в ткани опухоли 5637 обнаружены только минимальные фокусы дегенерации, в ткани опухоли EJ признаков некроза при гистологическом исследовании в этот срок не наблюдалось. По результатам оценки интенсивности иммуногистохимической реакции с анти-РЭФР антителом клетки ксенографтов EJ и 5637 слабо различались по общему уровню экспрессии РЭФР. При этом в клетках опухоли EJ наряду с окрашиванием цитоплазмы наблюдалось преимущественное окрашивание поверхностной мембраны (рис. 2в), а в различных участках ткани опухолевого образования картина иммуногистохимического окрашивания в целом была сходной. В клетках опухоли 5637 преобладала цитоплазматическая локализация РЭФР (рис. 2г), мембранное окрашивание можно было наблюдать в клетках некоторых структур, располагающихся по периферии опухолевого узла. Отработку условий ортотопической трансплантации клеток РМП человека выполняли, варьируя количество клеток, вводимых в мочевой пузырь мышей. Введение 1 х 106 клеток EJ или 5637 удовлетворительно переносилось животными. Однако на 20-е сутки после процедуры инстилляции признаки опухолевого роста в стенке мочевого пузыря были обнаружены только у 2 из 4 мышей в каждой группе и только по результатам гистологического исследования. При введении мышам 5 х 106 клеток EJ или 5637 в течение 14 сут после воздействия наблюдалась гибель животных. При вскрытии павших мышей установлено, что причиной гибели в обеих группах стало нарушение функции почек, которое развивалось как следствие перекрытия мочеточников опухолью, прорастающей стенку органа или заполняющей полость мочевого пузыря. Оптимальным признано внутрипузырное введение клеток EJ или 5637 в количестве 3 х 106 на мышь. По совокупным результатам независимо проведенных экспериментов выживаемость мышей, которым прививали клетки EJ, на 24-е сутки после воздействия составила 92 % (11 из 12 животных), выживаемость мышей, которым прививали клетки 5637 83 % (10 из 12 животных). На данный срок при вскрытии мышей в мочевом пузыре обнаруживали утолщение складок, экзофитные выросты различного числа и размера либо полное заполнение опухолью полости органа. Анализ результатов исследования методом магнитно-резонансной томографии, полученных у мышей на 20-й день после инстилляции опухолевых клеток, показал возможность прижизненного мониторинга роста ксенографтов. МРТ-изображения, представленные на рис. 3, демонстрируют пристеночные образования, выступающие в полость мочевого пузыря мышей, соответствующие растущей опухоли. Отмечено, что ксенографты, как правило, локализовались в области верхушки мочевого пузыря,что обусловлено положением тела наркотизированного животного во время процедуры. Гистологическое исследование подтвердило наличие опухолевого роста в мочевом пузыре у всех выживших животных. Репрезентативные микрофотографии парафиновых срезов мочевого пузыря животных-опухоленосителей представлены на рис. 4а, г. У большинства животных рост опухолей EJ и 5637, независимо от их размера, был ограничен слизистой оболочкой, т. е. уровень поражения стенки мочевого пузыря опухолью соответствовал стадии Т1. Однако у 3 из 12 мышей с ксенографтами EJ на поздний срок наблюдения выявлены признаки начала инвазии опухоли в мышечный слой стенки мочевого пузыря.По результатам иммуногистохимического окрашивания тканей характер экспрессии РЭФР в клетках ортотопических ксенографтов EJ и 5637 в целом был сходен с тем, что наблюдалось при исследовании подкожных опухолевых образований (рис. 4в, ё). При этом отмечено, что в клетках ортотопического ксенографта EJ выраженность цитоплазматического компонента окрашивания была существенно выше, чем в клетках подкожно растущих опухолей. Как следствие этого, обшая интенсивность окрашивания ортотопических ксенографтов EJ во всех исследованных случаях была существенно выше, чем интенсивность окрашивания ортотопических ксенографтов 5637. Для того чтобы проследить динамику формирования и роста имплантированных опухолевых клеток в стенке мочевого пузыря и оценить оптимальное время начала потенциального лечения, на модели ксенографга EJ проведено гистологическое исследование мочевого пузыря на различные сроки после процедуры внутрипузырной инсталляции клеток (4, 7, 10 и 14-е сутки). Метод иммуногистохимического окрашивания использован для оценки характера экспрессии РЭФР и распределения сосудов в образцах удаленных тканей. Было установлено, что регенерация уротелия у мышей nude после его химического повреждения происходит сравнительно быстро. На фоне полной реэпителизации покрова мочевого пузыря на 4-7-й день после внутрипузырного введения клеток EJ РЭФР-положительные (РЭФР+) клетки, как правило, располагались под уротелием (рис. 5а). Возможно, что выживанию опухолевых клеток, проникших под базальную мембрану, способствует хорошо развитая сеть CD34+ кровеносных капилляров, которая в стенке интактного мочевого пузыря пролегает непосредственно под базальной мембраной (рис. 6а). В дальнейшем, до 14-го дня наблюдения, в стенке мочевого пузыря можно было проследить распространение опухолевых клеток под слоем эпителия в собственной пластинке слизистой оболочки (рис. 56). Увеличение количества пролиферирующих клеток приводило к утолщению складок слизистой оболочки,формированию экзофитных выростов (рис. 5в), которые со временем сливались в единый массив, заполняющий полость органа (рис. 5г). Оптимальным сроком начала терапевтического воздействия у животных-опухоленосителей с ксенографтами EJ или 5637, с учетом динамики роста опухолевых образований, может считаться интервал до 7 дней после процедуры инстилляции опухолевых клеток. Количество и линейная протяженность депозитов опухолевых клеток варьировали у индивидуальных животных. При множественных фокусах имплантации рост опухолевых зачатков в разных участках слизистой оболочки мочевого пузыря был неодинаковым. Можно предположить, что вариативность числа опухолевых зачатков и скорость роста ксенографтов у животных-опухоленосителей определяются количеством опухолевых клеток, успешно осуществивших имплантацию в данном участке поврежденной слизистой оболочки. Исследование распределения микрососудов в опухолевой ткани показало, что в ткани ксенографта клетки эндотелия мыши образуют насыщенную капиллярную сеть, которая пронизывает всю толщу опухоли (рис. 66). Таким образом, ортотопическая модель опухоли EJ наглядно демонстрирует способность ксеногенных клеток привлекать ресурсы организма-хозяина для формирования адекватного кровоснабжения растущей опухолевой массы. На протяжении всего времени роста, до поздних его этапов, когда опухоли достигали значительных размеров, опухолевые югетки ксенографтов EJ и 5637, в отличие от естественно образующихся опухолей мочевого пузыря, не контактировали непосредственно с содержимым мочевого пузыря мышей и были отделены от полости органа слоем регенерировавшего уротелия. Необходимо отметить, что при внутрипузырном введении противоопухолевых лекарственных средств это обстоятельство может существенно ограничивать доступ активного компонента лекарства к опухолевым клеткам, особенно при воздействии на ранние сроки после инокуляции опухоли. Особого внимания заслуживают различия внутриклеточной локализации РЭФР в клетках опухолей EJ и 5637, выявленные при иммуногистохимическом окрашивании тканей ксенографтов. Поданным клинико-морфологических исследований, при некоторых злокачественных новообразованиях — раке поджелудочной железы, раке почки, немелко клеточном раке легкого — тип субклеточного распределения РЭФР в опухоли может служить независимым фактором клинического прогноза. По существующим представлениям преимущественная внутриклеточная локализация РЭФР может определяться активностью процессов интернализации рецептора, которая инициируется взаимодействием с лигандами, может зависеть от организации внутриклеточного транспорта комплекса рецептор — лиганд, а также от специфики взаимодействия внутриклеточных сигнальных путей. Совокупность этих процессов не только способна определять биологические особенности роста опухоли, но и может влиять на реализацию механизмов лечебного воздействия. Так, например, ожидаемыми являются результаты клинического исследования, показавшего, что у больных с распространенным немелкоклеточным раком легкого лечебный эффект химиотерапии в сочетании с цетуксимабом более выражен в случаях с высоким уровнем экспрессии РЭФР на поверхности опухолевых клеток. Заключение. С использованием клеточных линий EJ и 5637 нами получены ксенографты РМП человека у мышей nude, которые характеризуются хорошей воспроизводимостью роста и высоким уровнем экспрессии РЭФР. Хорошее кровоснабжение ткани подкожных и ортотопических ксенографтов РМП указывает на потенциально высокую доступность опухолевых клеток для системно вводимых лекарственных средств. Рост ортотопических вариантов ксенографтов в подслизистом слое мочевого пузыря накладывает определенные ограничения на их релевантность как моделей для изучения цитотоксических лекарственных средств, для которых предполагается внутри пузырный путь введения. Особенности локализации РЭФР в клетках ксенографтов EJ и 5637, выявленные в данной работе, могут служить критерием при выборе экспериментальной модели, а также дополнительным фактором анализа при интерпретации результатов экспериментального воздействия. Ксенографты EJ и 5637 могут быть полезны для разработки новых способов эффективного лечения РМП человека, в том числе, при экспериментальном изучении биотерапевтических воздействий, использующих РЭФР в качестве мишени.

Авторы:

Издание: Российский биотерапевтический журнал
Год издания: 2018
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.31-40. Библ. 34 назв.
Просмотров: 221