ЭКСПРЕССИЯ ОСНОВНЫХ ГЕНОВ ВНЕШНЕГО ПУТИ АПОПТОЗА У БОЛЬНЫХ С ВПЕРВЫЕ ВЫЯВЛЕННЫМ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФОЛЕЙКОЗОМ В СРАВНЕНИИ С КЛИНИЧЕСКИМИ ДАННЫМИ

Аннотация:

Приведенные данные фундаментальных исследований процессов апоптоза при В-клетонном хроническом лимфолейкозе (В-ХЛЛ) свидетельствуют о сложности и многообразии механизмов, влияющих на кинетику нормальных клеток и опухолевых лимфоцитов при данном заболевании. Важным является изучение выраженности клинических проявлений болезни в зависимости от экспрессии изучаемых генов, модулирующих апоптоз. Цель работы — сравнить активность генов, кодирующих модуляторы апоптоза, клеточного цикла и раково-тестикулярный белок PRAME с клиническими проявлениями болезни у первичных больных B-XЛЛ. У 23 больных с впервые выявленным B-XЛЛ был определен уровень экспрессии проапоптотических генов FAS, TRAIL, TNFR2, DR4/5 и DR3, а также генов HSP27, XIAP, блокирующих апоптоз. Кроме того, была изучена экспрессия генов ТР53 и Р21 и раково-тестикулярного гена PRAME. В результате согласно данным многофакторного регрессионного анализа, наибольшее влияние на клиническую характеристику болезни оказал уровень экспрессии гена FAS в дебюте заболевания. В связи с этим больные были разделены на группы с нормальным (I группа) и низким уровнем гена (II группа). Низкий уровень экспрессии FAS (Me 387 %) был ассоциирован со II стадией заболевания (р = 0,03), большим количеством лимфоцитов (р = 0,001), меньшим количеством эритроцитов (р — 0,08) и меньшим уровнем экспрессии генов TNFR2 (р = 0,08), высоким уровнем экспрессии XIAP, HSP27 и P21. В целом антиапоптотический потенциал у больных II группы был выше, что сопровождалось более выраженными клиническими проявлениями болезни. Заключение. Повышенный антиапоптотический потенциал опухолевых лимфоцитов при впервые выявленном B-XЛЛ сопровождается большей массой опухоли и более выраженными клинико-гематологическими проявлениями болезни. В-клеточный хронический лимфолейкоз (B-XЛЛ) относится к лимфопролиферативным заболеваниям и характеризуется вовлечением в патологический процесс костного мозга, крови, лимфатических узлов, печени и селезенки. Опухолевые клетки при В-ХЛЛ имеют аберрантный иммунофенотип (CD19+/CD5+/CD23+/CD201ow+/CD221ow+) и характеризуются низкой пролиферативной активностью. Многие авторы подтвердили снижение интенсивности апоптоза при В-ХЛЛ на основании иммунофенотипического анализа FASрецептора на поверхности опухолевых клеток, а также при изучении экспрессии белков семейства BCL2, каспазы-3 и цитокинов семейства TNF. Опубликованные фундаментальные исследования поданной проблеме позволяют охарактеризовать несколько рецепторзависимых (внешних) сигнальных путей апоптоза, которые могут быть моделью для изучения в опухолевых клетках при В-ХЛЛ. Взаимодействие FAS-лиганда и FAS-рецептора с последующей активацией каспаз через внутриклеточный адаптер и дальнейшая инициация апоптоза через каспазу-8 и каспазу-3 является основным механизмом активности апоптоза. Второй внешний путь активации апоптоза осуществляется за счет взаимодействия TNF и TNF-рецептора (TNFR1-2). Взаимодействие лиганд — рецептор сопровождается изменением конформации внутриклеточных адаптерных белков и передачи активирующего сигнала каспазе-8 и к каспазе-3, после чего осуществляется апоптоз. TNF-, TL1Aи TRAIL-зависимые системы, в отличие от FAS-, способны также подавлять апоптоз путем активации сигнального пути NF-kB. Взаимодействие TRAIL с его рецепторами семейства DR (DR4/5) может вызывать как активацию апоптоза, так и его торможение за счет активации N F-kB. К внешнему сигнальному пути активации апоптоза относится взаимодействие рецептора DR3 с лигандом TL1А, который по структуре не имеет принципиальных отличий от других лигандов семейства TNF. Важно подчеркнуть, что система TLla-DR3 контролирует как апоптотический, так и антиапоптотический сигнальные пути. Кроме рецепторов внешнего пути апоптоза существует множество других факторов, имеющих значение в выживании опухолевой клетки. Прежде всего это белок р53, «страж генома», распознающий повреждения и запускающий программу по их репарации или самоустранению клетки. Во время исправления повреждений р53 активирует белок р21, ингибирующий циклинзависимую киназу 1А и предотвращающий деление клетки. Следует отметить, что увеличение уровня экспрессии генов TP53 и Р21 при В-ХЛЛ связано с прогрессированием. При этом взаимодействие ТР53 и Р21 с генами внешнего пути апоптоза при В-ХЛЛ пока никем не проверялось. Другими факторами, потенциально значимыми в патогенезе В-ХЛЛ, могут быть гены HSP27и XIАР. Белок Hsp27 представляет собой шаперон, защищающий другие белки клетки от тепловой денатурации. Экспрессия Hsp27 позволяет опухолевой клетке проявлять большую устойчивость к стрессу. Вследствие этого прогноз онкологического заболевания ухудшается. Белок XIAP представляет собой ингибитор каспаз 3, 7 и 9. Это один из значимых маркеров неблагоприятного прогноза при онкологических и онкогематологических заболеваниях. Особенности экспрессии XIAP при В-ХЛЛ остаются неустановленными. Наконец, раково-тестикулярный белок PRAME также может быть значимым неблагоприятным признаком при В-ХЛЛ. Известно только, что активность данного маркера наблюдается чаще при более продвинутых стадиях заболевания. Особое внимание следует уделить тому факту, что ген PRAME находится в локусе гена ламбда-цепи иммуноглобулина, что может нарушать его синтез при L-клональности В-ХЛЛ, что улучшает прогноз болезни. Приведенные данные фундаментальных исследований процессов апоптоза при В-ХЛЛ свидетельствуют о сложности и многообразии механизмов, влияющих на кинетику нормальных клеток и опухолевых лимфоцитов при данном заболевании. Исходя из проведенного анализа важно также сравнение экспрессии генов рецепторов и лигандов внешнего пути апоптоза у здоровых людей и больных со впервые выявленным В-ХЛЛ, а также генов, блокирующих апоптоз. Важным является изучение выраженности клинических проявлений болезни в зависимости от экспрессии изучаемых генов, модулирующих апоптоз. Цель работы - сравнить активность генов, кодирующих модуляторы апоптоза, клеточного цикла и раково-тестикулярный белок PRAME с клиническими проявлениями болезни у первичных больных В-ХЛЛ. Изучение экспрессии проапоптотических и антиапоптотических генов и клинической характеристики у 23 больных с впервые выявленным В-ХЛЛ проведено в рамках проспективного клинического исследования. Был проведен исходный анализ экспрессии генов FAS, TRAIL, TNFR2, DR4/5, DR3, а также HSP27, XIАР, ТР53, Р21 и PRAME. Контрольную группу составили 14 здоровых людей. Среди исследуемых больных было 16 мужчин и 7 женщин в возрасте от 47 до 77 лет (средний возраст 64 года). Стадию болезни оценивали по Rai. В I стадии были 4 больных, во II стадии - 12, в III стадии - 1, в IV стадии - 6. Установление диагноза выполняли в соответствии с критериями, предложенными Международной рабочей группой по хроническому лимфолейкозу (IWCLL, 2008). Для проведения топографической характеристики распространенности опухолевого процесса использовали метод ультразвукового исследования с исследованием 6 зон: области шеи, подмышечной области, средостения, паховой области, брюшной полости и забрюшинного пространства, размеров печени и селезенки. Внутригрудное поражение оценивали методом компьютерной томографии. Для сравнительного анализа вводили понятия балльной оценки, где 1 зону поражения с обеих сторон принимали за 2 балла, с одной стороны - за 1 балл. Для оценки распространенности вычисляли сумму баллов. Поражение печени и селезенки оценивали баллами, где 0 - отсутствие поражения, 1 - размеры печени и селезенки меньше 5 см из-под края реберной дуги, 2 - размеры более 5 см. Выделение общей рибонуклеиновой кислоты из клеток крови и синтез комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты. Перед выделением рибонуклеиновой кислоты (РНК) 5 мл крови смешивали с 45 мл 0,9 % раствора NH4C1 и инкубировали в течение 10 мин. После этого проводили центрифугирование в течение 10 мин при 600g для осаждения лейкоцитов. Удаляли супернагант и клеточный осадок ресуспендировали в 1 мл физиологического раствора и центрифугировали в течение 5 мин при 600g. Из полученного осадка клеток далее выделяли РНК по классическому протоколу. Клеточный материал лидировали в 0,5 мл гуанидин-тиоционатного буфера (4М тиоционата гуанидина, 25 мМ цитрата натрия, 0,5 % N-лаурил-саркозината натрия и 0,1М меркаптоэтанола). Во время лизиса материал пропускали через иглу 19G не менее 20 раз. Далее в пробирку добавляли 0,5 мл водонасышенного фенола (рН 5,2) и 0,125 мл раствора ацетата натрия (рН 4,2), встряхивали и добавляли 0,25 мл хлороформа. Полученную смесь встряхивали до молочно-белого цвета и центрифугировали в течение 10 мин при 8000g и охлаждении до +4 °С. После центрифугирования отбирали 0,65 мл верхней водной фазы, содержащей клеточную РНК, и смешивали с 0,65 мл изопропанола. Инкубирование РНК в изопропаноле проводилось в течение 20 ч при температуре -20 °С. После инкубирования РНК осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 8000g, удаляли супернатант и 2 раза промывали в 80 % этаноле. После промывок осадок РНК высушивали в термостате в течение 20 мин при 37 °С, растворяли в 20 мкл деионизованной воды и измеряли концентрацию раствора. Для синтеза комплементарной дезоксирибонуклеиновой кислоты (кДНК) брали 2 мкг матричной РНК. Реакцию обратной транскрипции проводили с использованием фермента RevertAid Reverse и коммерческого набора реактивов (Fermentas, США) в условиях, предложенных фирмой-производителем. Лля отжига использовали смесь случайных гексамеров («Синтол», Россия). В качестве отрицательного контроля использовали рабочую смесь без добавления матричной РНК. Пробу доводили до конечного объема 165 мкл деионизованной воды. Количественная полимеразная цепная реакция в режиме реального времени. Количественную полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени проводили с использованием двукратной реакционной смеси (40 мМ трис-НС1, 100 мМ КС1, 4 мМ MgCl2,1 мМ каждого из 4 дезоксирибонуклеотидов и 0,2 мМ бета-меркаптоэтанола) и Taq ДНК-полимеразы (Fermentas, США). В каждую пробу было добавлено 5 мкл кДНК, по 250 нМ прямого и обратного праймера и 140 нМ флуоресцентного зонда. Подбор праймеров и флуоресцентных зондов проводили с помошью программы Vector NTI 10 на основе данных нуклеотидных последовательностей генов DR3, DR4/5, FAS, TNFR2, TRAIL, HSP27, XIАР, ТР53, P2I и PRAME, доступных на интернет-ресурсе http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed. В каждом образце был исследован уровень экспрессии анализируемых генов. Данный эксперимент проводили на приборе DTlite («ДНК-технология», Россия). Программа проведения реакций была следующей: предварительная обработка в течение 5 мин при 94 °С и 45 циклов денатурации в течение 10 с при 94 °С с последующим отжигом праймеров и синтезом в течение 12 с при 60 °С. Уровень экспрессии рассчитывали количественно относительно уровня экспрессии гена ABL.В качестве положительного контроля использовали векторы рЕТ-15b, экспрессирующие клонированные геномные последовательности. Правильность синтезированных последовательностей подтверждена секвенированием по Сэнгеру на анализаторе ABI Prism 310 Genetic Analyzer (Applied Biosystems, США). Перед секвенированием ам пли кон, полученный в результате П ЦР с праймерами, разработанными для анализа экспрессии генов, был обработан наборами BigDye™ Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, США) и BigDye® XTerminator™ Purification Kit (Applied Biosystems, США) в соответствии с инструкцией производителя. Статистический анализ данных. Для поиска связи уровня экспрессии изучаемых генов и клинических характеристик больных применялся многофакторный регрессионный анализ. Поскольку непрерывные данные имели ненормальное распределение, для статистического анализа использовали непараметрические критерии. Для исследования связи уровня экспрессии генов с качественными и количественными параметрами использовали критерии х2 и U-критерий Манна—Уитни соответственно. Для анализа величины изменения таких признаков, как количество лимфоцитов, размер лимфатических узлов, печени и селезенки, а также уровня экспрессии исследованных генов использовали критерий Уилкоксона. Различия между группами считали статистически значимыми при р <0,05. Количественные данные представлены в виде медианы значения и граничными значениями, охваченными доверительным интервалом 0,95. Для многофакторного регрессионного анализа в качестве независимых переменных были включены данные по уровню экспрессии генов DR3, DR4/5, FAS, TNFR2, TRAIL, PRAME, ТР53, Р21, HSP27wXIAP, а в качестве зависимой переменной - уровень лимфоцитов и другие клинические параметры. При сопоставлении активности генов FAS, DR4/5 и PRAME у больных и у здоровых людей было установлено их значимое различие (табл. 1). Поскольку у больных наблюдался большой разброс уровня экспрессии гена FAS, для дальнейшего исследования выборка была разделена на группы. В группу 1 были включены больные, имеющие уровень экспрессии гена FAS, близкий к уровню, наблюдаемому у здоровых доноров, обозначенный нами как нормальный уровень экспрессии. В группу 2 были включены все остальные больные. В качестве нижней границы нормального уровня экспрессии FAS использовался 25-й процентиль, наблюдаемый у здоровых доноров. При анализе показателей экспрессии генов в 2 группах больных в зависимости от значений гена FAS Экспрессия генов DR3, Р21, HSP27, XIAP была статистически значимо выше в группе с низким уровнем экспрессии FAS. Экспрессия генов TNFR2 и TRAIL в этой же группе была статистически значимо ниже, чем в группе с нормальным уровнем экспрессии гена FAS. Таким образом, в группе 2 была противоположная динамика значений генов DR3, Р21, HSP27vl XIAP относительно гена FAS и совпадающая динамика значений генов TNFR2 и TRAIL. Следующим этапом исследования было изучение экспрессии генов, модулирующих апоптоз в сравнении с клиническими данными (табл. 3). В результате установлено, что в группе больных с низким уровнем экспрессии гена FAS было статистически значимо большее поражение печени, большее количество лимфоцитов крови (р = 0,001), близкое к значимому снижение Нb и количества эритроцитов. Число больных I и II стадии болезни было статистически значимо ниже в группе с низкой экспрессией гена FAS. Проведенное исследование было посвящено изучению экспрессии генов внешних путей апоптоза, а также генов, блокирующих апоптоз при впервые выявленном B-XЛЛ. Была изучена экспрессия генов, обеспечивающих чувствительность к внешнему пути апоптоза DR3, DR4/5, FAS, TNFR2, TRAIL, а также генов-модуляторов апоптоза ТР53, Р21, HSP27 и XIAP, и раково-тестикулярного гена PRAMF, клиническое значение которых при B-XЛЛ в настоящее время недостаточно хорошо изучено. Следует подчеркнуть, что предпринятый подход в изучении процессов апоптоза при B-XЛЛ с позиции функциональной характеристики основных генов внешнего пути представляется достаточно новым и важным. Построение регрессионной модели позволило установить наиболее значимые факторы, влияющие на клинические параметры первичных больных. Это были гены FAS и XIAP. На основании активности гена MS были выделены 2 группы больных с нормальной (1-я группа) и низкой (2-я группа) его активностью. При сравнительном анализе отмечается статистически значимое снижение активности проапоптотических генов во 2-й группе больных. Это относится к генам FAS, TNFR2 и TRAIL с одновременным повышением экспрессии антиапоптотического гена XIAP. Установленное сочетание активности свидетельствует о повышенном генетическом потенциале, направленном на блокирование апоптоза в этой группе больных. В рамках этой концепции следует рассматривать повышение экспрессии гена P2I, блокирующего пролиферацию (р = 0,03) и повышение экспрессии HSP27, снижающего активность апоптоза (р = 0,03). При этом затруднена оценка достоверного повышения экспрессии гена DR3 во 2-й группе больных в связи с его вариабельным влиянием на процессы апоптоза. Экспрессия гена PRAME в исследуемой группе больных В-ХЛЛ была диагностически незначима.Заключение. Сравнительный анализ экспрессии генов, модулирующих апоптоз, в 2 группах больных, разделенных по уровню экспрессии гена FAS, показал более выраженный антиапоптотический потенциал в группе с низкой активностью этого гена. Проведенный сравнительный клинико-генетический анализ позволил выявить более выраженные проявления болезни во 2-й группе больных с большим антиапоптотическим потенциалом опухолевых лимфоцитов. Это касается большей инфильтрации печени (р = 0,03), лимфоцитоза (р = 0,001), сниженного уровня Нb (р = 0,08) и количества эритроцитов (р = 0,08), а также продвинутой стадии болезни (р = 0,03). В целом проведенная работа показала, что повышенный антиапоптотический потенциал опухолевых лимфоцитов при впервые выявленном В-ХЛЛ сопровождается большей массой опухоли и большими клинико-гематологическими проявлениями болезни.

Авторы:

Издание: Российский биотерапевтический журнал
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.41-46. Библ. 18 назв.
Просмотров: 93