МОНОКЛОНАЛЬНЫЕ АНТИТЕЛА СЕРИИ ИКО В ТРЕХЦВЕТНОМ АНАЛИЗЕ СУБПОПУЛЯЦИЙ Т-ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ОНКОЛОГИЧЕСКИХ БОЛЬНЫХ

Аннотация:

Клинические исследования показали, что у большинства онкологических больных наблюдаются нарушения иммунологической реактивности. Мониторинг состояния иммунной системы больных с солидными опухолями включает субпопуляционный анализ иммунокомпетентных клеток (ИКК), основанный на изучении экспрессии поверхностных антигенов и внутриклеточных структур, и анализ функциональной активности ИКК. В настоящее время для субпопуляиионного анализа лимфоцитов человека используют двух-, трех- и даже четырехцветные реакции иммунофлуоресценции (РИФ), позволяющие одновременно определять в одном образце несколько различных антигенов. Для этого используют сбалансированные смеси («коктейли») иммунофлуоресцентных зондов (ИФЗ) различной антигенной специфичности, несущих разную флуоресцентную метку. В ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н. И. Блохина» Минздрава России путем конъюгирования моноклональных антител (МКА) серии ИКО и флуоресцентных красителей — флуоресцеина в форме изотиоцианатного эфира (FITC), моносукцинимидного эфира Alexa-488, цианиновых производных Imd306, Imd506 и растительного белка группы фикобилипротеинов фикоэритрина (РЕ) получены и охарактеризованы лабораторные образцы ИФЗ. Исследования этих конъюгатов показали их пригодность для одно- и двухцветного анализа субпопуляций лимфоцитов периферической крови человека методом проточной цитометрии. Цель исследования — оценить возможность совместного использования нескольких ИФЗ на основе различных МКА серии ИКО и красителей FITC, Imd306, Imd506u РЕ для трехцветного анализа субпопопуляций лимфоцитов здоровых людей и пациентов с онкологическими заболеваниями методом проточной цитометрии. В работе использовали панель ИФЗ, включающую зонды CD3-FITC, CD4-PE, CD8-Imd506, CD4-Imd306, полученные конъюгированием МКА серии ИКО разной специфичности и флуорофоров FITC, РЕ, Imd306 и Imd506 соответственно. Специфическую активность зондов оценивали в монохромных, двух- и трехцветных РИФ методом проточной цитометрии. Для оптимизации состава смесей ИФЗ и условий постановки РИФ в качестве исследуемого биологического материала использовали образцы венозной крови практически здоровых доноров. Клиническую апробацию полученных «коктейлей» проводили на 2 группах пациентов с онкологическими заболеваниями до и после хирургического лечения. Первая группа включала 64 больных раком слизистой оболочки полости рта. Вторая группа — 35 больных раком яичников. В результате показано, что для трехцветного анализа лимфоцитов человека методом проточной цитометрии рекомендуется использовать наборы меченых МКА: CD3-FITC (10мкг/мл) + CD4-Imd306 с концентрацией 5— 10мкг/мл; CD3-FITC + CD4-PEc концентрацией 20мкг/мл и CD3-FITC + CD8 Imd506 с концентрацией 10мкг/мл. Указана конечная концентрация иммуноглобулина в растворе ИФЗ. Показано, что еще до начала лечения у больных раком слизистой оболочки полости рта в структуре F-клеток статистически достоверно снижено содержание CD3+CD4+, а общий уровень С D8+ лимфоцитов достоверно превышает показатели донорской группы. Анализ линейных маркеров, характеризующих основную структуру лимфоидных клеток у первичных больных раком яичников, позволил выявить статистически значимое снижение по сравнению с показателями у доноров общего количества CD3+ F-лимфоцитов. Не выявлено влияния проведенного хирургического лечения на показатели субпопуляционной структуры лимфоидных клеток. Заключение. Комбинации флуоресцентных зондов CD3-FITC/CD4-Imd306/CD8-Imd506 и CD3-FITC/CD4-PE/CD8-Imd506 могут использоваться для трехцветного анализа методом проточной цитометрии субпопуляций лимфоцитов как практически здоровых доноров, так и онкологических больных. Сравнительные исследования специфической активности комбинаций ИФЗ на основе МКА серии ИКО и референтных коммерческих тест-систем (BD Biosciences) на лимфоцитах здоровых доноров и онкологических больных (рак яичников, рак слизистой оболочки полости рта) показали сопоставимые результаты. Применение полученных зондов позволило выявить нарушения субпопуляционной структуры лимфоцитов периферической крови у больных раком яичников и раком слизистой оболочки полости рта, в частности CD3-/CD8CD3+/CD4+, CD3+. Среди иммунологических факторов в противоопухолевой защите доминирующая роль отводится клеточному иммунному ответу. Наиболее активными клетками в разрушении опухоли являются Т-лимфоциты и NK-клетки, оказывающие свое прямое (в результате индукции апоптоза или путем выделения гранзима В и перфорина) или опосредованное продукцией цитокинов действие на клетки-мишени, а также макрофаги и дендритные клетки. Клинические исследования показали, что у большинства онкологических больных присутствуют нарушения иммунологической реактивности. Мониторинг состояния иммунной системы больных с солидными опухолями включает субпопуляционный анализ иммунокомпетентных клеток (ИКК), основанный на изучении экспрессии поверхностных антигенов и внутриклеточных структур, и анализ функциональной активности ИКК. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводится методом проточной цитометрии с использованием антител к дифференцировочным антигенам лейкоцитов. Если до недавнего времени такого рода исследования проводились в режиме монохроматического анализа, то сегодня для субпопуляционного анализа лимфоцитов используют двух-, трех- и даже четырехцветные реакции. Такой подход позволяет проводить исследование клеточного звена иммунитета в норме и при патологии на современном уровне, оценивать содержание и функциональную активность различных клеточных субпопуляций (клеток эффекторного звена, регуляторных клеток), проводить дифференциальную диагностику патологических состояний. Для выполнения таких анализов применяются смеси несколькихиммунофлуоресцентных зондов (ИФЗ). Каждый из них обладает собственной антигенной специфичностью и индивидуальными спектральными характеристиками. Флуоресцентные зонды для иммунофенотипирования лейкоцитов человека получают конъюгированием специфических моноклональных антител (МКА) к поверхностным и внутриклеточным антигенам с флуоресцентными красителями. Выбор пригодных для цитометрического анализа флуорофоров прямо связан с конструкцией цитометра, в первую очередь с длиной волны возбуждающего флуоресценцию светового пучка, а также со спектральными диапазонами каналов регистрации флуоресцентного сигнала. В нашей стране исследования в области гибридомной технологии привели к созданию собственных панелей МКА. В Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Блохина (ранее Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина) были получены и охарактеризованы МКА серии ИКО, на основе которых в дальнейшем получены конъюгаты с флуорофорами в форме изотиоцианатного эфира (FITC), растительного белка группы фикобилипротеинов фикоэритрина (РЕ), цианиновых производных lmd306, lmd506, моносукцинимидного эфира Alexa-488. Показано, что ИФЗ на основе МКА серии И КО по специфической активности не уступают коммерческим аналогам в однои двухцветном анализе субпопуляций лимфоцитов человека. Цель данного исследования — оценить возможность совместного использования нескольких ИФЗ на основе различных М КА серии И КО и красителей FITC, lmd306, Imd506 и РЕ для трехцветного анализа субпопуляций лимфоцитов здоровых лиц и пациентов с онкологическими заболеваниями методом проточной цитометрии. В работе использовали панель ИФЗ CD3-F1TC, CD4-PE, CD8-Imd506, CD4-Imd306. Зонды получены на основе соответствующих МКА серии ИКО и флуорофоров FITC, РЕ, Imd306, Imd506. Характеристика этих ИФЗ представлена в табл. 1. В качестве референтного контроля применяли прямо меченные МКА производства BD Biosciences (США): CD3-FITC, CD4-PE, CD8-PE. Фосфатно-солевой буфер (PBS) (ООО «ПанЭко», Россия) готовили по инструкции производителя, рН готового раствора 7,4. Эритроциты, содержащиеся в образцах крови, разрушали с использованием лизирующего раствора FACS Lysing Solution (BD Biosciences, США). Для оптимизации состава смесей ИФЗ и условий постановки реакции иммунофлуоресценции (РИФ) в качестве исследуемого биологического материала использовали образцы венозной крови практически здоровых доноров. Кровь забирали из локтевой вены натощак, в качестве антикоагулянта использовали этилендиаминтетрауксусную кислоту. Клиническую апробацию полученных «коктейлей» проводили на 2 группах пациентов с онкологическими заболеваниями до и после хирургического лечения: 1-я группа включала 64 больных раком слизистой оболочки полости рта, 2-я - 35 больных раком яичников. В прямой РИФ клетки крови здоровых доноров инкубировали с конъюгатами МКА в течение 20 мин при 18-25 °С в темноте. Эритроциты лизировали раствором FACS Lysing Solution (BD Biosciences, США). He связавшиеся с клетками МКА удаляли двукратной отмывкой PBS (рН 7,4) и фиксировали образцы PBS с содержанием 0,4 % формальдегида.В работе использовали проточный двухлучевой питометр FACSCalibur (BD Bioscience, США) с программным пакетом CellQuest. Флуоресценцию учитывали в спектральных диапазонах 512—547 нм (FL1 для FITC), 575-595 нм (FL2 для РЕ, Imd306) и 650670 нм (FL4 для Imd506). Для анализа клеточных популяций учитывали также показатели прямого малоуглового (FSC) и бокового (SSC) светорассеивания, на основании которых выполняли гейтирование — программное «выделение» субпопуляции лимфоцитов и дискриминацию иных субпопуляций. В каждом образце анализировали 5000 событий в гейте лимфоцитов. Обработку файлов первичных цитометрических данных проводили с использованием программного пакета WinMDI 2.8, находящегося в свободном доступе в сети Интернет. Использовали программное обеспечение Sigma Plot 11.0 для Windows. Достоверность различий в исследовании оценивали по t-критерию Стьюдента и непараметрическим критериям Вилкоксона-Манна—Уитни и Фишера в зависимости от характера распределения значений выборки. Различия считали достоверными при р <0,05. Для определения достоверности корреляционной связи между данными, полученными с применением эталонных реагентов и экспериментальных флуоресцентных зондов, рассчитывали ранговый коэффициент корреляции Спирмена. Все результаты представлены в виде средней арифметической и ее стандартной ошибки. В отличие от монохромной РИФ, при постановке реакции для многоцветного анализа в реакционной смеси с клетками крови одновременно присутствуют 2 и более флуоресцентных зонда, в связи с чем должно учитываться их возможное взаимное влияние на конечные результаты анализа. Так, выявляемые разными зондами антигенные эпитопы могут располагаться на клеточной поверхности в непосредственной близости друг к другу таким образом, что связывание одного зонда со «своим» антигеном создает стерическое препятствие для связывания с клеткой другого зонда, в результате чего полученный результат анализа может оказаться не равным сумме отдельных монохромных реакций. Для определения рабочего титра растворов полученных ИФЗ использовали метод титрования антител, предложенный С.С. Stewart [22]. Метод основан на дробном разведении раствора ИФЗ с определением предельного значения фактора разведения, при котором в прямой РИФ еще сохраняется максимальная интенсивность флуоресценции антигенпозитивных клеток. Ранее нами показано, что для двухцветного анализа лимфоцитов человека методом проточной цитометрии рекомендуется использовать наборы меченых МКА: CD3-F1TC (10 мкг/мл) + CD4-Imd306 с концентрацией 5—10 мкг/мл; CD3-F1TC + CD4-PE с концентрацией 20 мкг/мл и CD3-FITC + CD8 Imd506 с концентрацией 10 мкг/мл. Указана конечная концентрация иммуноглобулина в растворе ИФЗ. Для оценки возможности совместного применения различных зондов в одной трехцветной РИФ используется простой методический прием: в 4 пробирки вносят образец исследуемой крови, после чего в 1-ю пробирку добавляют раствор 1-го ИФЗ (например, CD3-F1TC) в оптимальной конечной концентрации, во 2-ю пробирку - раствор 2-го ИФЗ (например, CD4-Imd306 или CD4-PE), в 3-ю - раствор 3-го ИФЗ (CD8-Imd506), а в 4-ю - смесь всех 3 зондов в той же конечной концентрации каждого. После выполнения прямой РИФ все 4 образца анализируют на проточном цитометре. По результатам анализа строят гистограммы распределения зарегистрированных событий по 1-му каналу флуоресценции (FL1) для содержимого пробирки № 1 и 4 (CD3-FITC), по 2-му каналу (FL2) - для пробирок № 2 и 4 (CD4-Imd306 или CD4-PE), по 4-му каналу (FL4) — для содержимого пробирок № 3 и 4 (CD8Imd506). Гистограммы, построенные по результатам монохромного анализа (пробирки № 1—3), должны с точностью совпадать с соответствующими гистограммами трехцветного анализа (пробирка № 4). Если на гистограммах по результатам анализа содержимого пробирки № 4 положение пика специфической флуоресценции смещается влево относительно того же пика для пробирок № 1 и/или № 2, 3, в реакционной смеси для трехцветной РИФ следует увеличить конечную концентрацию соответствующего зонда до достижения требуемого соответствия. Если это не приводит к положительному результату, данная смесь зондов не может использоваться для трехцветного окрашивания в одной реакции. Возможность использования полученных ИФЗ в трехцветном анализе продемонстрирована ниже: на рис. 1 а представлена 3D-диаграмма распределения лимфоцитов крови здорового донора при трехцветном анализе с использованием «коктейля» зондов CD3-FITC (FL1) с конечной концентрацией 10 мкг/мл, CD4-PE (FL2) с концентрацией 20 мкг/мл, CD8-Imd506 (FL4) с концентрацией 10 мкг/мл. На рис. 1б— 3D-диаграмма распределения лимфоцитов того же образца крови при трехцветном анализе с использованием «коктейля» зондов CD3-FITC (FL1) с конечной концентрацией 10 мкг/мл, CD4-Imd306 (FL2) с концентрацией 10 мкг/мл, CD8-Imd506 (FL4) с концентрацией 10 мкг/мл. В обеих комбинациях используется одна пара зондов CD3-FITC и CD8-Imd506, а 3-й компонент обеих смесей различен: CD4-Imd306 (10 мкг/мл) в 1-й смеси или CD4-PE (20 мкг/мл) - во 2-й. Работоспособность каждого из этих ИФЗ «в составе смеси» определяется по степени совпадения гистограмм, полученных в монохромном или в многоцветном анализе клеточных популяций. На рис. 2а представлены совмещенные гистограммы по каналу FL1 для монохромного (голубое заполнение) и многоцветного (черный контур) анализа, на рис. 26 - аналогичные совмещенные гистограммы по каналу FL4. Гистограммы практически идентичны, что указывает на отсутствие негативного влияния каждого из этих ИФЗ на связывание зондов со своими антигенами-мишенями при их одновременном и совместном использовании в испытанных концентрациях. Аналогичным образом проанализирована пригодность для работы «в составе смеси» 3-го компонента испытанных смесей ИФЗ: CD4-PE (20 мкг/мл) или CD4-Imd306 (10 мгк/мл). На рис. 3 представлены совмещенные гистограммы по каналу FL2 для монохромного (голубое заполнение) и многоцветного (черный контур) анализа с использованием ИФЗ CD4-Imd306 (рис. За) или ИФЗ CD4РЕ (рис. 36). В обоих случаях гистограммы также практически идентичны, что свидетельствует об одинаковой работоспособности ИФЗ в испытанных концентрациях как по отдельности друг от друга (монохромная реакция), так и в составе смеси. Результаты, представленные на рис. 1 и 3, показывают, что для ИФЗ, в котором в качестве метки использован флуорофор РЕ, характерна значительно более высокая интенсивность флуоресцентного сигнала по каналу FL2, чем для ИФЗ с меткой Ind306, что выражается в максимальном разделении антиген-негативного («левый») и антиген-позитивного («правый») пиков гистограммы. В связи с этим выбор CD4-PE для использования в многокомпонентных смесях ИФЗ для выполнения трехцветного анализа субпопуляций Т-лимфоцитов очевиден. На рис. 4 представлены двумерные дот-плот диаграммы распределения лимфоцитов крови донора при их трехцветном анализе с использованием зондов CD3-FITC (FL1) + CD4-PE (FL2) + CD8-Imd506 (FL4). На рис. 4а четко выделяются субпопуляции Т-клеток с даблпозитивным фенотипом CD3+CD4+ (48,4 % - верхний правый квадрант) и прочих Т-лимфоцитов CD3+CD4-(24,3 % - нижний правый квадрант); суммарное содержание Т-лимфоцитов в популяции, таким образом, составляет 72,7 %. На диаграмме рис. 4б субпопуляция цитотоксических даблпозитивных Т-лимфоцитов CD3+CD8+ составляет 23,5 %(верхний правый квадрант), в то время как популяция прочих Т-лимфоцитов насчитывает 49,3 % клеток в выбранном гейте (правый нижний квадрант), что в сумме также приводит к результату 72,8 % Т-лимфоцитов в составе всей клеточной популяции. Одновременно обнаруживается минорная субпопуляция лимфоцитов CD3-CD8+, которая составляет около 6,3 % от всех клеток выбранного гейта (верхний левый квадрант рис. 46). Практически идентичные результаты получены при анализе того же образца крови с применением комбинации ИФЗ CD3-FITC (FL1)/CD4-Imd306 (FL2)/CD8-Imd506 (FL4) (рис. 5). Контрольные значения, полученные при анализе того же образца крови донора с применением коммерческих препаратов сравнения, составили: CD3+CD4+ 47,7 %; CD3+CD8+ — 24,6 %, CD3-CD8+- 5,9 %,что соответствует результату анализа, выполненного с использованием отечественной панели ИФЗ. Таким образом, обе испытанные комбинации ИФЗ — CD3-FITC/CD4-Imd306/CD8-Imd506 и CD3-FITC/ CD4-PE/CD8-Imd506 могут использоваться для трехцветного анализа субпопуляций лимфоцитов человека методом проточной цитометрии. Из 2 наборов предпочтительным выбором является комбинация зондов, содержащая CD4-PE. Далее проводили сравнительный анализ специфической активности флуоресцентных зондов на основе МКА серии И КО и референтных реагентов CD3-FITC/CD4-PE, CD3-FITC/CD8-PE (BD Biosciences, США). В качестве исследуемого материала использовали периферическую кровь здоровых людей в возрасте от 25 до 59 лет (18 женщин, 21 мужчины) (см. табл. 2). Испытание полученных наборов ИФЗ на основе М КА серии И КО в анализе лимфоцитов здоровых доноров показало их высокую специфичность и эффективность, не уступающую зарубежным аналогам, конкретно — конъюгатам производства BD Biosciences, США. Клиническая апробация наборов Клиническая апробация полученных наборов проводилась в 2 группах больных онкологическими заболеваниями: 1-я группа включала 64 больных раком слизистой оболочки полости рта до и после хирургического лечения, 2-я — 35 больных раком яичников до и после хирургического лечения. 1-я группа. В работе использованы материалы клинических наблюдений 64 первичных больных раком слизистой оболочки полости рта, находившихся на обследовании и лечении в отделении опухолей головы и шеи ФБГУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в период с 2009 по 2012 г. Диагноз плоскоклеточного рака был установлен первично, без проведения в предоперационном периоде химиолучевой терапии, и подтвержден гистологически. В исследование включены больные с 11—1Vстадией заболевания, примерно в равном соотношении по полу, в возрасте от 20 до 88 лет. Наибольшая частота этого заболевания наблюдалась у пациентов в возрастном диапазоне от 50 до 59 лет. Всем больным на 1-м этапе было проведено хирургическое лечение. В табл. 3 представлены результаты иммунологического обследования до и после хирургического лечения (через 10—14 дней после операции) по сравнению с группой здоровых лиц. Показано, что еще до начала лечения у больных раком слизистой оболочки полости рта в структуре Т-клеток статистически достоверно снижено содержание CD3+CD4+, а общий уровень CD8+ лимфоцитов достоверно превышает показатели донорской группы. Не выявлено влияния проведенного хирургического лечения на показатели субпопуляционной структуры лимфоидных клеток. Группа 2. В исследование включены 35 первичных больных раком яичников, госпитализированных в гинекологическое отделение НИИ клинической онкологии ФБГУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России для выполнения планового хирургического лечения. Средний возраст по группе составил 53,9 года. В зависимости от гистологической структуры опухоли больные распределились следующим образом: серозный рак — 62,1 %, муцинозный рак — 13,8 %, эндометриоидный рак — 20,7 %, светлоклеточный рак — 3,4 %. Иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови проводили до хирургического лечения и через 2 нед после него. Анализ линейных маркеров, характеризующих основную структуру лимфоидных клеток у первичных больных раком яичников, позволил выявить статистически значимое снижение по сравнению с показателями у доноров общего количества CD3+ Т-лимфоцитов. Проведенное хирургическое лечение также не влияло на динамику распределения этих показателей, что, возможно, связано с коротким послеоперационным периодом наблюдения. В то же время разброс минимальных и максимальных значений (М ± 5) в Т-клеточном (до лечения 62,5 ± 16,5 %, после лечения — 61,8 ± 14,4 %) звене иммунитета свидетельствует о неоднородности анализируемых больных по уровню основных популяций иммунокомпетентных клеток. Заключение. Комбинации флуоресцентных зондов CD3-F1TC/ CD4-Imd306/CD8-Imd506 и CD3-FITC/CD4-PE/ CD8-Imd506 могут использоваться для трехцветного анализа субпопуляций лимфоцитов методом проточной цитометрии как практически здоровых доноров, так и онкологических больных. Сравнительные исследования специфической активности комбинаций ИФЗ на основе МКА серии И КО и референтных коммерческих тест-систем (BD Biosciences) на лимфоцитах здоровых доноров и онкологических больных (рак яичников, рак слизистой оболочки полости рта) показали сопоставимые результаты. Применение полученных зондов позволило выявить нарушения субпопуляционной структуры лимфоцитов периферической крови у больных раком яичников и раком слизистой оболочки полости рта, в частности CD3-/CD8+, CD3+/CD4+, CD3+.

Авторы:

Издание: Российский биотерапевтический журнал
Год издания: 2018
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.47-56. Библ. 22 назв.
Просмотров: 38