СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ IN VIVO ПОТЕНЦИАЛЬНЫХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫХ СВОЙСТВ В РЯДУ АМИНОКИСЛОТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ГЛИКОЗИДОВ ИНДОЛОКАРБАЗОЛА (РАЗВЕРНУТОЕ СООБЩЕНИЕ)
Полный текст
L-треонин L-серин L-тирозин L-тирозин (метиловый эфир) III группа. L-аланин L-валин IV группа. глицин бета-аланин ГАМК V группа. L-аргинин (нитропроизводное) L-лизин (Кбз-производное) L-глутаминовая кислота VI группа. L-триптофан L-фенилаланин VII группа L-метионин L-метионина сульфоксид. Оценку результатов лечения проводили по показателям торможения роста опухолей (ТРО) и увеличения продолжительности жизни (УПЖ). ТРО вычисляли по формуле ТРО (%) = (v-vo)/vKxm, где К и F — средний объем опухолей (мм3) в контрольной и опытной группах соответственно, который для каждой солидной опухоли определяли как произведение размеров 3 перпендикулярных диаметров опухолевого узла. Измерение объема опухолей проводили каждые 4 дня после окончания лечения. УПЖ леченых животных по сравнению с контролем вычисляли по формуле УПЖ (%) = (СПЖо - СПЖк) / СПЖк х 100, где СПЖо и СПЖк - средняя продолжительность жизни (сутки) в опытных и контрольных группах животных соответственно. Показатели эффективности изучаемого препарата определяли в сравнении с контрольными группами. Активными в противоопухолевом отношении считали дозы препаратов, вызывающие ТРО >50 % продолжительностью не менее 8—12 дней после окончания лечения или УПЖ животных >25 %. Токсичность препаратов в использованных режиме и дозах оценивали по срокам гибели леченых животных в сравнении с гибелью животных в контрольной группе. Трупы животных утилизировали в соответствии с санитарными правилами НМИЦ онкологии. Для выполнения экспериментов составляли группы численностью, достаточной для проведения статистического анализа и расчета показателей достоверности. Для всех количественных данных вычисляли групповое среднее арифметическое (М) и стандартную ошибку среднего (SEM). Различия между контрольными и экспериментальными группами считали достоверными при 95 % уровне значимости (р <0,05). Статистическую обработку данных выполняли с помощью программы Statistica for Windows 5.5. Значимый прогноз (57-74 %) вероятности противоопухолевой активности АПГИК был дан на основе их исследования in silico. Для сравнительного изучения соединений АПГИК in vivo при подборе условий эксперимента был выбран глюкозид L-треонина. Титрование доз обычно проводят в опытах на мышах с лимфоидным лейкозом Р388. Однако выбранный глюкозид не показал активности на лимфолейкозе Р388. На меланоме В16 получили только непосредственный эффект 80 % ТРО. На аденокарциноме молочной железы Са755 в дозе 120мг/кг с ежедневным 5-кратным введением с интервалом 24 ч соединение выявило непосредственный эффект 73 % ТРО, сохранявшийся до 12-го дня наблюдения после окончания лечения (табл. 1). Несмотря на то что на модели Са755 были получены противоопухолевые эффекты, она неудобна для экспериментов, так как имеет выраженную сезонную зависимость.Далее глюкозид L-треонина изучали на модели рака шейки матки РШМ5. В исследованиях на этой модели он показал высокую противоопухолевую активность: после окончания лечения 93 % ТРО, с сохранением на уровне 63 % ТРО до 18-го дня наблюдения, а в отдельных опытах — до 21—29-го дня, с У ПЖ мышей до 25 %, что укладывалось в принятые критерии потенциальной противоопухолевой активности препарата. При поиске новых активных в противоопухолевом отношении соединений в ряду производных АПГИК противоопухолевое действие оценивали по показателям ТРО и УПЖ, полученным в результате лечения мышей с опухолью РШ М5 по методике, принятой для глюкозида треонина: растворы препаратов в дозе 100мг/кг вводили внутрибрюшинно 5-кратно ежедневно через 24 ч. В каждом опыте глюкозид треонина использовали как стандарт сравнения. Результаты изучения противоопухолевого действия производных АПГИК на мышах с опухолью РШМ5 представлены в табл. 2. В группе I сравнивали L-треониновые производные глюкозида и рибозида карбазола. Результаты показали преимущество глюкозидного производного L-треонина перед рибозидным: ТРО 93-61 % до 21-го дня наблюдения с УПЖ 25 % или 70-50 % до 8-го дня наблюдения после окончания лечения с УПЖ 23 % соответственно. Далее сравнивали L- и D-треониновые глюкозиды, где по результатам исследования L-изомер превосходил по активности D-изомер. Сравнительное изучение противоопухолевой активности глюкозидов группы II с наличием гидроксила в боковой цепи аминокислоты показало, что при лечении глюкозидом серинового производного непосредственный противоопухолевый эффект после окончания лечения 61 % ТРО сохранялся на этом уровне до 22-го дня наблюдения, на 25-й день ТРО был равен 48 %, УПЖ - 19 %. Глюкозиды L-тирозина и его метилового эфира сохраняли ТРО в пределах 80-56 % до 8-12-го дня наблюдения без УПЖ. Гибели леченых животных в группах не было. Глюкозиды группы III содержали алкильный заместитель в остатке аминокислоты. Глюкозид производного L-аланина, так же как и L-тирозина (II группа), сохранял противоопухолевое действие до 12-го дня наблюдения, без УПЖ. Для производного L-валинадоза 100 мг/кгв использованных условиях оказалась токсичной (гибель 3 мышей из 7), а доза 75 мг/кг вызывала минимальный противоопухолевый эффект: не выше 59 % ТРО только до 12-го дня наблюдения, без УПЖ, с гибелью 1 мыши в группе. Глюкозиды группы IV имели открытую карбоксильную группу, разно удаленную от ароматического ядра карбазола. У производного глицина ТРО изменялся волнообразно, но не превышал 55 % на 21-й день наблюдения после окончания лечения. Наличие в молекуле глюкозида остатка [3-аланина вызывало умеренный противоопухолевый эффект 62—59 % ТРО, который сохранялся до 22-го дня. У производного у-аминомасляной кислоты ТРО изменялся с 80 до 49 % (16-й день наблюдения). У 2 соединений (производных глицина и у-аминомасляной кислоты) наблюдалась гибель 1 мыши без УПЖ. Глюкозиды группы У несли в остатке аминокислоты протоноакцепторный или протонодонорный фрагмент. Производные нитрон-аргинина, карбобензоксиН-лизина (КбзН-лизина) и L-глутаминовой кислоты обладали невысокой противоопухолевой активностью: непосредственно после окончания лечения в пределах 50-65 % ТРО, которая, однако, сохранялась у всех групп мышей в процессе наблюдения на уровне ТРО 57-61 % до 16-го дня и 48-54 % на 25й день, а противоопухолевая активность производного лизина, изменяясь волнообразно, достигала 65 % ТРО на 29-й день. УПЖ наблюдался для всех соединений, но не достигал принятого критерия 25 %. Глюкозиды группы VI содержали ароматический фрагмент в боковой цепи аминокислоты. На модели опухолевого роста РШМ5 в стандартных дозах и режиме производное L-триптофана вызывало гибель 2 животных из 6 при минимальных показателях активности: ТРО <56 % до 8-го дня наблюдения. Глюкозид, содержащий остаток L-фенилаланина, при той же гибели мышей проявлял умеренную активность до 29-го дня наблюдения - 54 % ТРО, без УПЖ. При снижении дозы до 75 мг/кг противоопухолевый эффект составлял 72—49 % ТРО только до 16-го дня, уменьшаясь как по величине, так и по продолжительности, но без гибели животных. Глюкозиды группы VII имели содержащий серу фрагмент в боковой цепи аминокислоты. Глюкозид, имеющий остаток L-метионина, в дозе 100 мг/кг вызывал противоопухолевый эффект 71-52 % ТРО, сохраняющийся до 21-го дня, без УПЖ, с гибелью 1 мыши в группе, а производное сульфоксида L-метионина не проявило противоопухолевой активности в принятых критериях. Изученный в 1 опыте с препаратами VII группы глюкозид индолопиролокарбазола, не имевший аминокислотного остатка при пирольном атоме азота карбазола, проявляет непосредственный эффект 86 % ТРО, который к 4-му дню снижается до 53 % и далее, без УПЖ. Таким образом, проведенные эксперименты подтвердили результаты прогноза in silico о высокой вероятности противоопухолевой активности соединений АПГИК (см. табл. 2). В то же время лечение препаратами, включенными в группы III, IV, VI и VII, сопровождалось гибелью животных либо умеренными значениями ТРО. При отсутствии остатка аминокислоты в молекуле глюкозид индолопирролокарбазола, невзирая на предсказанную вероятность 81% противоопухолевого эффекта, проявил значимый процент ТРО только до 4-го дня после лечения. Путем анализа полученных результатов для дальнейшего расширенного изучения были выбраны 5 глюкозидов карбазола: производные L-треонина, L-серина, нитро-L-аргинина, Кбз-L-лизина и L-глутаминовой кислоты. Заключение Использование возможностей компьютерного анализа для вероятностной оценки противоопухолевых свойств соединений на основе их виртуальной структуры — важнейший в настоящее время этап направленного поиска лекарств. В работе, являющейся продолжением изучения аминокислотных производных гликозидов индолопирролокарбазола АПГИК в качестве потенциальных противоопухолевых средств, были удачно использованы прогностические возможности компьютерной программы PASS. Была подтверждена спрогнозированная in silico значимая противоопухолевая активность АПГИК в опытах in vivo на мышах с опухолью рака шейки матки РШМ5 с отбором 5 лидерных соединений для углубленного изучения. Важно отметить, что по результатам определения цитотоксической активности in vitro в экспериментах на 5 видах опухолевых клеток (1С50 >10 мкМ) соединения АПГИК должны были быть отбракованы в соответствии с принятыми в настоящее время критериями отбора соединений на дальнейшее изучение, но подтвердили перспективность углубленного исследования.
Наличие в молекуле индолокарбазола остатка активного метаболита (аминокислоты) изменяет физико-химические и пролекарственные свойства аминокислотных производных гликозидов индолокарбазола (АПГИК). Компьютерным методом была ранее предсказана низкая вероятность их цитотоксической активности in vitro, что было подтверждено в МТТ-тесте на 5 линиях опухолевых клеток. Тем же компьютерным методом была спрогнозирована значимая вероятность противоопухолевой активности АПГИК in vivo, что требует экспериментальной проверки. Цель исследования — оценка противоопухолевой активности АПГИКи выбор наиболее эффективных соединений. Исследование противоопухолевой активности All ГИК проводили на опухолевой модели мышей — раке шейки матки PIIIM5. Соединения вводили мышам СБА/Lac внутрибрюшинно 5-кратно ежедневно с интервалом 24 ч. Наблюдение за животными продолжали до их гибели. Противоопухолевый эффект препаратов оценивали по торможению роста опухоли, увеличению продолжительности жизни опытных мышей по сравнению с контрольными животными. В результате оттитрована оптимальная доза для данного ряда соединений, равная 100мг/кг. Оценена противоопухолевая активность этих соединений на модели PIUM5. Выводы. На основе полученных данных предполагается расширенное исследование in vivo противоопухолевых свойств отобранных 5 лидерных соединений АПГИК. Конференция Всемирной организации здравоохранения осенью 2017 г. была посвящена борьбе с неинфекционными, в том числе онкологическими, заболеваниями как важнейшей проблеме здравоохранения в мире. В докладе от 1 ноября 2017 г. министр здравоохранения Российской Федерации В.И. Скворцова доложила о разработке в России инновационных таргетно действующих иммунопрепаратов в области онкологии. Эти весьма затратные изыскания необходимы для создания персонально действующих лекарств с учетом гетерогенности опухолевых клеток и их множественной лекарственной устойчивости по отношению к известным препаратам. В то же время актуальны и значительно менее затратны исследования, посвященные поиску противоопухолевых низкомолекулярных иммунопрепаратов и опирающиеся на возможность компьютерного прогнозирования их биологической активности. В работе авторы провели оценку перспективности создания производных N-гликозидов индолокарбазола, содержащего в гетероциклическом ядре аминокислотные остатки, как потенциальных противоопухолевых средств. В настоящее время за рубежом проходят II—III фазы клинических испытаний N-гликозилированных производных индоло[2,3-а]пироло [3,4-с]карбазола, в которых гетероциклическая часть препарата обусловливает его противоопухолевые свойства, а заместители, в том числе углеводный остаток, модулируют растворимость и пути фармакокинетического продвижения лекарства в организме. Добавление в структуру молекулы индоло[2,3-а] пироло[3,4-с]карбазола остатков аминокислот или пептидов способно значительно видоизменить фармакокинетические свойства таких производных индолокарбазолов, что определяется биологической активностью введенных компонентов, участвующих в важнейших процессах энергообмена в клетке. Аминокислотные производные гликозидов индолокарбазола (АПГИК) были синтезированы в лаборатории химического синтеза ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России (НМИЦ онкологии) и предоставлены для исследований. Ранее показано, что в соответствии с данным in silico прогнозом (информационно-компьютерные технологии для доэкспериментального скрининга и прогнозирования различных свойств и биологической активности по структурным формулам соединений) с использованием программы PASS соединения АПГИК не обнаружили цитотоксическую активность in vitro: показатель цитотоксической активности 1С50 >10 мкМ был подтвержден в МТТ-тесте на 5 линиях опухолевых клеток. При этом производные АПГИК проявили значимую противоопухолевую активность in vivo в опытах на мышах с перевиваемой опухолью рака шейки матки РШМ5, чему соответствовали данные прогноза о значимой вероятности противоопухолевой активности АПГИК (57— 74 %). Помимо этого, предсказанные in silico их биологические свойства, в том числе вероятность 60 % наличия иммуностимулирующего действия у ряда соединений АПГИК, лягут в дальнейшем в основу изучения механизма их противоопухолевой активности. Цель исследования - анализ результатов сравнительного изучения противоопухолевых свойств соединений АПГИК in vivo в опытах на мышах с перевиваемой опухолью РШМ5 и выделение среди них веществ, наиболее перспективных для дальнейшего расширенного изучения. Опыты проводили на мышах-самках в возрасте 1,5-2 мес с начальной массой тела 19-23 г, гибридах 1-го поколения F1 (DBA/2 х C57Bl/6j) (B6D2F1) с меланомой В16 и раком молочной железы Са755, линии DBA2 с лимфолейкозом Р388, линии CBA/Lac с раком шейки матки РШМ5. Животных получали из филиала «Столбовая» ФГБНУ «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства» и содержали в экспериментально-биологической лаборатории (виварий) ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России в соответствии с санитарными правилами по содержанию лабораторных животных: на брикетированном корме и постоянном доступе к воде, в помещении с естественным освещением, контролируемыми температурой 18—22 °С и влажностью воздуха 65 %. Клетки из полипропилена, подстил — опилки. Противоопухолевую активность in vivo гликозидов АПГИК определяли по методике, принятой в НМИЦ онкологии для экспериментов с использованием асцитных и солидных моделей опухолевого роста мышей. Штаммы перевиваемых опухолей получали из банка опухолевых штаммов НМИЦ онкологии и поддерживали in vivo в лаборатории экспериментальной химиотерапии на линейных животных. В опытах использовали 2—10-й пассажи штаммов in vivo. Перед лечением мышей распределяли по группам. Число животных в контрольной группе составляло 10, в опытных группах - по 5-7. Солидные опухоли перевивали половозрелым мышам массой тела 18—23 г в возрасте 1,5-2 мес. Инокуляцию опухолевых клеток проводили подкожно в правую подмышечную область каждой мыши по 50 мг опухолевой взвеси в среде 199 в разведении 1:10 (5 х 106 клеток). Лейкозные клетки перевивали самкам гибридам BDF, внутрибрюшинно по 106 клеток на мышь в 0,4 мл питательной среды 199. Лечение мышей с асцитной опухолью начинали через 24ч, а мышей с солидными опухолями — через 48 ч после перевивки опухолей. Препараты вводили внутрибрюшинно ежедневно в течение 5 дней с интервалом 24 ч. Навески соединений растворяли в диметилсульфоксиде и разводили физиологическим раствором до 10 % концентрации для получения готовых препаратов с концентрацией 5 мг/мл. Растворы препаратов готовили ex tempore. Наблюдение за животными проводили до их гибели. Исходя из подобия строения аминокислот, использованных в синтезе производных индолокарбазола, соединения сравнивали, объединяя в группы с I по VII, и проводили в одном опыте лечение соединениями отдельно взятой группы. I группа. L-треониновое производное N-глюкозида индолопирролокарбазола; L-треониновое производное N-рибозида индолопирролокарбазола; D-треониновое производное N-глюкозида индолопирролокарбазола; N-глюкозид индолопирролокарбазола. Далее изучаемые соединения разделили по группам - N-глюкозиды индолопирролокарбазола для следующих аминокислот: II группа.
Голубева И.С.Горюнова О.В.Яворская Н.П.
Российский биотерапевтический журнал
2018
7с.
2018.-N 2.-С.71-77. Библ. 13 назв.
50
Посетитель (IP-адрес: 3.145.84.16)
Добавить в коллекцию