МОДИФИКАЦИЯ РЕАКЦИИ БЛАСТТРАНСФОРМАЦИИ ЛИМФОЦИТОВ ДЛЯ ПРИМЕНЕНИЯ В АЛЛЕРГОЛОГИЧЕСКОЙ ПРАКТИКЕ

Аннотация:

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ) востребована для обследования пациентов с иммунологическими нарушениями. Она применяется в различных областях медицины для выявления сенсибилизации к антигенам (аллергены). Цель исследования — провести модификацию и автоматизацию РБТЛ для применения в рутинной лабораторной практике. РБТЛ, антигены (аллергены). Программное обеспечение Windows 7; процессор Intel Pentium G4500. Цифровая КМОП-видеокамера, микроскоп «Микмед-6». В результате мы провели анализ трудностей при постановке РБТЛ в лабораторной аллергологической практике и разработали компьютерную программу для автоматизации РБТЛ. Заключение. Мы адаптировали и автоматизировали реакцию РБТЛ для применения в лабораторной диагностике. Реакция бласттранформации лимфоцитов (РБТЛ) разработана в 1960-1970 гг., однако до сих пор не потеряла своей актуальности. На сегодняшний день РБЛТ востребована при обследовании пациентов с иммунологическими нарушениями в различных областях медицины для выявления сенсибилизации к антигенам (аллергенам). Накопленный опыт ее применения привел к необходимости ее модификации и автоматизации. В качестве основы метода используется способность сенсибилизированных лимфоцитов переходить в форму бластов под действием сенсибилизировавшего их антигена. В настоящее время РБТЛ востребована дня обследования пациентов с иммунологическими нарушениямив различных областях медицины, чаще всего во фтизиатрии, ревматологии, иммунологии, аллергологии. РБТЛ используется специалистами для оценки клеточного звена иммунитета при подозрении на иммунопатологическое состояние, для оценки функциональной активности лимфоцитов, для выявления клеточной сенсибилизации. Исследуют общую способность лимфоцитов человека к бласттрансформации под действием ФГА или антигена, а также к спонтанной бласттрансформации (без митогена). Реакция спонтанной бласттрансформации возможна у пациентов в следующих случаях: воспалительный процесс любой этиологии, заболевания крови, состояние после массивного инвазивного вмешательства, состояния после облучения (в том числе повышенный радиационный фон), использование препаратов, влияющих на процессы кроветворения, а также другие воздействия, приводящие к стрессовой реакции иммунной системы. В аллергологии данный метод используется для подтверждения или выявления сенсибилизации к антигенам (аллергенам). РБТЛ является наиболее точной при подозрении у пациентов гиперчувствительности замедленного типа, которая может наблюдаться как при контакте с инфекционным антигеном, так и при аллергических реакциях. Метод особенно важен при диагностике медикаментозной сенсибилизации. Метод РБТЛ при отсутствии других способов диагностики позволяет анализировать возможные риски развития аллергических реакций. Цель работы — провести модификацию и автоматизацию РБТЛ для применения в рутинной лабораторной практике. 1. Для постановки реакции у больного берут 5-10 мл крови в пробирку, содержащую 100-200 ЕД гепарина, перемешивают и помещают на 60 мин в термостат при 37 °С для осаждения эритроцитов. 2. Надосадочный слой плазмы с лимфоцитами отсасывают в стерильную пробирку. Для оптимальной активации необходимо наличие небольшого числа макрофагов (моноцитов), поэтому не рекомендуется использовать высокоочищенные препараты лимфоцитов. 3. Определяют число лимфоцитов в 1 мкл надосадочного слоя. 4. Взвесь лимфоцитов разводят питательной средой 199, так чтобы в 1 мл содержалось 1—2 млн лимфоцитов. Оставшуюся аутоплазму используют в дальнейшей работе для приготовления питательной среды для культивирования лимфоцитов данного пациента, разводя средой 199. 5. Приготовленную лимфоцитарную взвесь разливают в стерильные флаконы по 1 мл и добавляют необходимое количество антигена. 6. Флаконы помешают в термостат (Т = 37 °С) до 72 ч максимум. Более длительное время инкубации не рекомендуется во избежание ложноположительной реакции. 7. Готовят мазки на стеклах и подсчитывают количество лимфоцитов, перешедших в бластную форму, по отношению к общему числу лимфоцитов. 8. Параллельно следует провести отрицательный контроль (т. е. по аналогичной схеме культивировать лимфоцитарную взвесь без добавления антигена в среду), так как возможны реакции спонтанной (неспецифической) бласттрансформации. В качестве положительного контроля можно использовать реакцию на неспецифический митоген (фитогемагглютинин) по аналогичной схеме. 9. Рассчитывают результаты по формуле: определяют количество бластных клеток на 1000 клеток общего количества, после чего рассчитывают процент. Полученный результат сравнивают с контрольными образцами, культивированными при аналогичных условиях без добавления аллергена. Формула расчета: 1(%) = Бл/(Лц + Бл), где: 1(%) — индекс процентного соотношения бластных клеток в образце; Бл — бластные клетки в образце; Лц — лимфоциты в образце. Реакцию можно считать положительной при 5—35 % бластных клеток от общего числа клеток по сравнению с контрольным (отрицательным) образцом. Мы не рекомендуем проводить окрашивание мазков в связи с последующим подсчетом на электронно-вычислительных машинах. Красящие пигменты формируют нежелательный фон и лишние структурные элементы, что затрудняет настройку контрастности/освещенности микроскопа и фотоаппарата. Для упрощения и автоматизации обработки полученных данных мы разработали компьютерную программу, проводящую подсчет результата исследования с фотоснимков образцов предметного стекла в режиме online. В основу программных файлов автоматической дифференцировки клеток (лимфоцитов и бластных форм) мы положили их морфологические различия. В таблице представлены морфологические характеристики лимфобластов и лимфоцитов.На рис. 1 представлены результаты микроскопии взвеси лимфоцитов и лимфобластов в культуральной среде. Различия клеток не вызывают сомнений, что делает возможным их подсчет в автоматическом режиме. Несмотря на более чем 30-летний период использования, сохраняются определенные трудности при постановке данной реакции. 1. Метод достаточно трудоемок в связи с проведением реакции в 2 этапа: постановка реакции с предшествующей подготовкой образца и подсчет/анализ полученных результатов врачом-лаборантом. 2. Отсутствуют стандартизированные аллергены для многих диагностикумов медицинского (лекарственные препараты, материалы для протезирования и прочее) или бытового применения (ингредиенты косметических средств, средств бытовой химии, синтетических изделий, строительных материалов и т. д.). Однако потребность и необходимость в диагностике сенсибилизации человека к таким объектам возрастает пропорционально развитию промышленной индустрии и синтезу новых материалов. 3. Необходимость стерилизации помещения и диагностического образца (для предотвращения инфицирования культуры клеток при длительном сроке инкубирования). Возможность применения антибиотиков и противогрибковых препаратов крайне нежелательна во избежание ложноположительных результатов. Данная проблема решается с помощью стерилизации образца. Выбор способа стерилизации/ дезинфекции зависит от состава исследуемого вещества (УФ-облучения, обработки спиртом и проч.). 4. Возможность ошибки при обработке результатов врачом-лаборантом вручную под контролем зрения в связи с человеческим фактором. Данная проблема решается с помощью автоматизации подсчета результатов с помощью компьютера. Нами было разработано программное обеспечение для автоматизации подсчета лимфоцитов и лимфобластов в подготовленных образцах по стандартному протоколу. Препараты представляли собой неокрашенные мазки обогащенной лимфоцитами сыворотки крови на предметном стекле в разведении. Проводилась световая микроскопия на лабораторном микроскопе «Микмед-6» (ЛOMO, г. Санкт-Петербург). Для получения цифрового изображения поля зрения на микроскоп была установлена цифровая КМ О П-видеокамера с разрешением 8 Мп, использовался штатный объектив микроскопа 40 х 0,65. На рис. 2 представлены исходное фото образца и фото после его программной обработки. Программное обеспечение работает под управлением операционной системы Windows 7 на персональном компьютере с процессором Intel Pentium G4500, тактовая частота 3,5 ГГц. Изображение передается в реальном времени на монитор лаборанта,необходимая четкость изображения контролируется микровинтом микроскопа. По нажатию клавиши производятся автоматическое распознавание и подсчет числа лимфоцитов и лимфобластов на фотоизображении. Для распознавания использовались 6 моделей (3 модели лимфоцита, 3 модели лимфобласта) клеток, в которых учитывались их размер, форма и структура (яркость участков). В целом лимфобласты описывались как более крупные клетки с равномерной бледной окраской. Процесс распознавания занимал примерно 8 с и отображался на экране для возможности контроля лаборантом. Для повышения достоверности исследования автоматический подсчет проводился в нескольких полях зрения с наличием клеток и без артефактов по всей площади мазка. В среднем обсчитывалось 5 полей зрения. Исследование прекращалось при превышении числа распознанных клеток 1000, рассчитывалось процентное соотношение числа лимфобластов к общему числу лимфобластов и лимфоцитов. Результаты регистрировались в электронной карте. В связи с необходимостью тестирования аллергенов разнообразного состава и консистенции мы разработали рекомендации для отбора и подготовки диагностических образцов для исследования. 1. Твердые субстраты (не растворимые в биологических жидкостях и воде) необходимо стерилизовать с помощью автоклавирования (или ультрафиолета). Стерильные образцы можно вводить в культуру клеток в неизменном виде. Однако нами отмечено, что в данном случае основное взаимодействие лимфоцитов с аллергеном происходит непосредственно на диагностическом образце, что затрудняет оценку реакции. Следует максимально снимать клетки с твердофазного диагностикума, иначе часть бластных форм остается «прилипшей» к образцу. 2. Твердые образцы, растворимые в биологических жидкостях или воде, следует предварительно развести с соблюдением стерильности до получения однородной жидкой структуры. 3. Жидкие образцы аллергенов при введении в культуру клеток нужно разводить в среде 199. Для избежания цитотоксичного эффекта жидкий диагностический образец необходимо титровать. Мы использовали следующие разведения: 1/25,1/50,1/100, 1/200 (использовать менее 3 разведений аллергена нецелесообразно в связи с малой информативностью получаемого результата). Не исключено токсическое действие примесей в диагностическом материале. При оценке результата каждый образец сравнивался с контрольным. 4. При возможности точного пересчета добавляемого образца необходимая концентрация неинфекционного аллергена должна составлять 1000 PNH в 1 мл, лекарственного вещества — 10 мкг в 1 мл. 5. Использование аэрозольных, масляных, эмульсионных, кремовых и прочих субстанций для постановки РБТЛ непригодно в связи с невозможностью технического исполнения протокола методики. 6. Тестирование многокомпонентных образцов (растворы, смеси, сплавы и прочее) может быть сопряжено со сложностью интерпретации результатов. Не исключается токсическое действие примесей. При оценке полученного результата важно учитывать особенности фармакокинетики и фармакодинамики медикаментов и их метаболитов. У пациентов с полипрагмазией важен грамотный сбор анамнеза врачом-аллергологом перед проведением обследования. 7. Тестирование бактериальных, вирусных, грибковых субстанций (равно как и инфицированных образцов) нецелесообразно в связи с прямым инфекционно-токсическим действием. Например, шерсть/ перхоть/другие биологические субстраты животных, нестерильные жидкости (использованные косметологические или медицинские средства и прочее) непригодны для диагностики в связи с невозможностью провести стерилизацию без изменения молекулярной структуры. 8. Забор материала крови у пациента должен производиться при отсутствии воспалительного процесса любой этиологии. В период воспаления возможны реакции неспецифической трансформации, что делает невозможным получение правильной оценки результата РБТЛ. С момента последнего периода болезни (острого состояния или обострения хронического) должно пройти не менее 7 дней. 9. Для получения адекватных результатов исследования кровь пациента должна быть использована в кратчайшие сроки с момента забора (не более 1 сут хранения при физиологических условиях). Пациент и врач должны быть предупреждены, что использование иммунокорректируюших средств (как стимулирующих, так и супрессантов) накануне исследования может исказить результаты теста. РБТЛ имеет высокую диагностическую ценность в качестве дополнительного критерия верификации аллергических реакций или выявления сенсибилизации у пациентов. Разработанная нами модификация и автоматизация РБТЛ существенно снижает трудозатратность метода и повышает качество результатов, что позволяет ее внедрять в рутинную лабораторную практику.

Авторы:

Издание: Российский биотерапевтический журнал
Год издания: 2018
Объем: 5с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.88-92. Библ. 9 назв.
Просмотров: 1196