Генетические факторы мужского бесплодия, их сочетания и спермиологическая характеристика мужчин с нарушением фертильности

Аннотация:

Цель исследования — установить частоту генетических факторов, влияющих на мужскую репродуктивную функцию, их сочетаний и изучить их влияние на сперматогенез и сперматологические показатели. Обследовано 393 мужчины с бесплодием в браке, которые по результатам цитогенетического анализа распределены по 3 группам: 135 мужчин с числовыми аномалиями половых хромосом; 58 пациентов, имеющих сбалансированные структурные аномалии хромосом; 200 мужчин с нормальным кариотипом. Выполнен поиск микроделеций Y-хромосомы, мутаций гена CFTR и анализ числа CAG-повторов гена AR. В результате у13 % пациентов с мутациями половых хромосом обнаружены микроделеции Y-хромосомы, представленные частичными делециями региона AZFc. В группе пациентов со структурными перестройками сочетание хромосомных нарушений с AZF-делециями и/или мутациями гена CFTR и повышенным числом CAG-повторов в гене AR отмечено у 19 % пациентов. У мужчин с нормальным мужским кариотипом частота исследованных генетических факторов примерно в 2 раза выше, чем у пациентов с аномалиями хромосом. Среди мужчин с бесплодием с нормальным кариотипом и мужчин с аномалиями кариотипа азооспермия диагностирована с одинаковой частотой (58 %). У всех мужчин, у которых выявлено наличие 2 и более различных генетических факторов мужского бесплодия, выявлены тяжелые формы патозооспермии. Заключение. При наличии в генотипе сочетания генетических факторов мужского бесплодия наблюдаются более тяжелые формы патозооспермии. Это свидетельствует о возможном аддитивном влиянии сочетания генетических факторов на сперматогенез и фертильность мужчин. Бесплодие диагностируют у 5—7 % мужчин в общей популяции. Нарушение репродуктивной функции может быть вызвано генетическими, средовыми факторами, а также их сочетанием. К генетическим факторам нарушения фертильности относят хромосомные и генные мутации, эпигенетические изменения. Хромосомными аномалиями, обусловливающими нарушения фертильности у мужчин, являются числовые аномалии половых хромосом (синдром Клайнфельтера, гоносомный мозаицизм, сбалансированные структурные перестройки хромосом и несбалансированные перестройки хромосом, вариации числа копий (сору number variation)). Частыми генетическими нарушениями, которые связаны с мужским бесплодием, считаются синдром Клайнфельтера, микроделеции Y-хромосомы, мутации и полиморфизмы в гене муковисцидоза (CFTR) и в гене андрогенового рецептора (AR/HUMARA). Наиболее изученные микроструктурные хромосомные перестройки при мужском бесплодии — микроделеции длинного плеча Y-хромосомы. Их обнаруживают с частотой примерно 1 на 1000 мужчин. AZF-делеции могут быть полными, т. е. целиком удаляющими один или более регион локуса AZF (AZFa, AZFb или AZFc), и частичными, не полностью захватывающими какой-либо из AZF-регионов. Почти все полные AZFделеции являются мутациями de novo и приводят к секреторной азооспермии или олигозооспермии тяжелой степени. Влияние частичных AZF-делеций на сперматогенез и фертильность мужчин может быть негативным, а может отсутствовать. Мутации гена CFTR достаточно часто встречаются у мужчин с нарушением фертильности. Они вызывают муковисцидоз, синдром врожденной двусторонней аплазии семявыносящих протоков (congenital bilateral aplasia of vas deferens, CBAVD), обструктивную форму азооспермии. У мужчин с нарушением фертильности наблюдаются различные варианты CAG-полиморфизма в экзоне 1 гена AR/HUMARA. Нарушение сперматогенеза выявляется чаще у носителей «длинных» (27 и более) CAG-аллелей, чем у фертильных мужчин. Анализ научных публикаций свидетельствует о том, что, несмотря на большое количество исследований, четкой классификации генетических причин мужского бесплодия, которая учитывала бы все формы и фенотипические проявления, до сих пор не существует. Мало или фрагментарно изучены сочетания различных генетических факторов, снижающих фертильность, их клинические последствия и фенотипические эффекты. Цель исследования — установить частоту генетических факторов, влияющих на мужскую репродуктивную функцию, их сочетаний и изучить их влияние на сперматогенез и сперматологические показатели. Обследованы 393 неродственных российских мужчины, обратившихся по поводу бесплодия в браке. Проводили стандартное спермиологическое, цитогенетическое, молекулярно-генетическое исследование (микроделеций локуса AZF, мутаций и полиморфизмов гена CFTR и числа CAG-повторов гена AR). По результатам цитогенетического исследования были сформированы 3 группы: 1-я группа — 135 мужчин с числовыми аномалиями половых хромосом (с синдромами Клайнфельтера, дисомии Y-хромосомы); 2-я группа — 58 мужчин, имеющих сбалансированные структурные мутации хромосом (реципрокные и робертсоновские транслокации, инверсии); 3-я группа — 200 мужчин с нормальным кариотипом (46,XY). Стандартный спермиологический анализ выполняли по общепринятой методике; его результаты оценивали по критериям Руководства Всемирной организации здравоохранения по лабораторному исследованиюэякулята человека и взаимодействия сперматозоидов с цервикальной слизью. Для цитогенетического исследования использовали препараты метафазных хромосом культивированных лимфоцитов периферической крови в соответствии со стандартной процедурой с использованием GTGокрашивания. Результаты цитогенетического исследования приведены согласно Международной системе цитогенетической номенклатуры хромосом человека. Молекулярно-генетическое исследование выполняли на ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови с помощью набора реактивов для выделения DNA РгерЮО по протоколу производителя. Для поиска микроделеций Y-хромосомы применяли метод мультиплексной амплификации. Для определения микроделеций в локусе AZF использовали набор из 19 маркеров (SRY, ZFY, sY84, sY86, sY127, sY134, sY254, sY255, sY6l5, sY1237, sY1235, sY121, sY124, sY1302, sY142, sYl 192, sYl 197, sY1206, sYl 125). Детально методика описана ранее. Ген CFTR анализировали на наличие 22 частых мутаций (F508del, CFTRdele2,3 (21kb), 394delTT, I507del, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT, L138ins, G542X, W1282X, N1303K, R334W, 3849+10kbOT, 604insA, 3944delGT, SI 196X,621+lq>t, E92K, 4022insT, 4015delA, 3272-26A>T), суммарно составляющих около 77 % от общего числа поврежденных хромосом, а также полиморфизм IVS8-Tn. Детально методика описана ранее. Для анализа CAG-полиморфизмов экзона 1 гена AR/HUMARA применяли подход, предложенный R.C. Allen и соавт. Статистический анализ проводили с помощью программы Excel из пакета программ Microsoft Office 2013, используя точный критерий х2 Пирсона. Значимыми считали различия при уровне вероятности р <0,05. Микроделеции Y-хромосомы выявлены у 71 (18 %) обследованного пациента. Полные AZF-делеции в 1-й группе не обнаружены, а во 2-й и 3-й группах обнаружены соответственно у 1 (1,7 %) и 25 (12,5 %) пациентов. Частичные делении региона AZFc определены у 43 мужчин: у 13(9,6 %), 7 (12 %) и 23 (11,5 %) пациентов соответственно 1, 2 и 3-й групп. Не установлено значимых различий частоты частичных AZFc-делеций как между группами, так и между мужчинами, имеющими и не имеющими аномалии кариотипа (х2 = 0,131;р >0,05). Частые мутации и полиморфизм IVS8-5T гена CFTR проанализированы у 164 пациентов: у 25 мужчин из 1-й группы, 16 пациентов 2-й группы, 123 пациентов 3-й группы. Мутации или 1VS8-5T (аллель 5Т — мягкая варьирующая мутация гена CFTR) обнаружены у 18 пациентов: у 2 пациентов 1-й группы (5Т), у 3 мужчин 2-й группы (мутация и гомозиготность по 5Т), у 13 пациентов 3-й группы (3 мутации и 10 аллелей 5Т). Между этими группами не выявлено значимых различий в частоте мутаций (х2 = 0,971; р >0,05). Обнаружены следующие мутации: у 8 пациентов — аллель 5Т, у 3 — мутации в гетерозиготной форме (F508del/N, 2184insA/N, N1303K/N), у 2 — мутации CFTR в компаунд-гетерозиготном состоянии с IVS8-5T (mutCFTR/5T), что характерно для генотипа, не вызывающего муковисцидоз, но приводящего у мужчин к развитию синдрома CBAVD и обструктивной азооспермии. Полиморфизм числа CAG-повторов в экзоне 1 гена AR/HUMARA исследован у 152 мужчин: у 86 пациентов 1-й группы, 16 пациентов 2-й группы и 52 пациентов 3-й группы. Количество CAG-повторов варьировало от 14 до 37. Среднее количество CAG-повторов существенно не различалось между группами и составило в 1-й группе 22 ± 3, во 2-й группе — 22 ± 3, в 3-й группе - 23 ± 3. Полные мутации данного локуса гена AR (количество CAG-повторов более 40) не выявлены ни у одного из обследуемых. Повышенное количество CAGповторов (> 27) обнаружено у 11 (13 %) пациентов 1-й группы, у 1 (7 %) пациента 2-й группы и у 7 (13,4 %) пациентов 3-й группы. Сниженное (< 17) количество CAGповторов определено у 5 (5,8 %) мужчин с синдромом Клайнфельтера и 1 (7 %) пациента из 2-й группы. Среди пациентов 3-й группы «короткие» CAG-аллели не выявлены. Значимых различий частоты «длинных» CAG-аллелей между пациентами с нормальным и аномальным кариотипом не обнаружено (х2 = 0,003;р >0,5). Сперматологическая характеристика мужчин с нарушениями репродуктивной функции, имеющих числовые аномалии половых хромосом (1-я группа). В этой группе обследовано 120 пациентов с синдромом Клайнфельтера и 15 пациентов с дисомией Y-хромосомы, имеющих их мозаичные или другие цитогенетические варианты (табл. 1). Наиболее частый цитогенетический вариант синдрома Клайнфельтера представлен кариотипом 47,XXY, который выявлен у 105 (87,5 %) пациентов. Мозаичные формы и другие цитогенетические варианты синдрома Клайнфельтера обнаружены у 15 (12,5 %) пациентов. Среди мужчин с дисомией Y-хромосомы ее регулярная форма — кариотип 47,XYY — определен у 13 (86,6 %). У 2 (13,4 %) мужчин с дисомией Y-хромосомы выявлены мозаичный вариант 46,XY/47,XYY и сочетание дисомии Y-хромосомы с робертсоновской транслокацией - 46,XYY,der(13;14)(ql0;ql0). В 1-й группе спермиологическое исследование проводили у 87 пациентов, из них 76 — с синдромом Клайнфельтера и 11 — с дисомией Y-хромосомы. Анализ эякулята не выполнен остальным пациентам в связи с недоступностью биологического материала. Нарушения сперматогенеза различной степени тяжести диагностированы у всех обследованных пациентов (табл. 1).Азооспермия или криптозооспермия обнаружена у 67 (88 %), олигоастенотератозооспермия тяжелой степени — у 7 (9 %), астенотератозооспермия — у 2 (2,6 %), астенозооспермия — у 3 % спермиологически обследованных пациентов с синдромом Клайнфельтера. Азооспермия обнаружена у 4 (36,4 %), олигоастенотератозооспермия — у 5 (45,5 %), астено-/тератозооспермия — у 2 (18 %) спермиологически обследованных пациентов с дисомией Y-хромосомы. При молекулярно-генетическом анализе у 23 (17 %) из 123 обследованных пациентов 1-й группы выявлены различные генетические факторы: у 12 пациентовс синдромом Клайнфельтера, у 3 пациентов с дисомией Y-хромосомы — частичные делении региона AZFc (b2/b3, gr/gr), у 7 пациентов с синдромом Клайнфельтера — увеличенное (27 и более), у 2 — уменьшенное (17 и менее) количество CAG-повторов в экзоне 1 гена AR/HUMARA. Гетерозиготность по CAGаллелям определена у 55 пациентов, гомозиготность — у 53 пациентов с синдромом Клайнфельтера, в том числе среди мозаиков гетерозиготы — 3, гомозиготы — 9. У всех пациентов, имеющих сочетание хромосомных аномалий и генных мутаций/факторов нарушения мужской фертильности, выявлены тяжелые формы патозооспермии (табл. 2). Сперматологическая характеристика мужчин с нарушением репродуктивной функции, имеющих структурные мутации хромосом (2-я группа). Данная группа включала 58 пациентов с первичным бесплодием, у которых по результатам цитогенетического исследования выявлены сбалансированные структурные мутации хромосом. Эта группа составила 30 % обследованных пациентов с хромосомными аномалиями. В спектре исследованных структурных мутаций хромосом большую часть составили сбалансированные реципрокные (преимущественно аутосомно-аутосомные) транслокации, обнаруженные у 27 (47 %) пациентов, а также робертсоновские транслокации, в основном с вовлечением хромосом 13 и 14 (кариотип 45,XY,der(13;14)(qlO;qlO)), выявленные у 23 (40 %) пациентов. Перицентрические инверсии определены у 4 (7 %) пациентов, из них аутосомные (хромосом 7, 18) - у 3, хромосомы Y - у 1. Комплексные хромосомные перестройки выявлены у 3 (5 %) пациентов: 46,XY,t(5;15) (p22;q32);t(6;12)(ql5;q21);46,XY,t(5;ll)(q31,l;q33)t(6;18) (q25,l;p11,2), сочетание транслокации и инверсии -46,XY,t(7;9)(q31;q34)inv(9)(q32;q34). У 1 мужчины с азооспермией обнаружена кольцевая хромосома 22 (кариотип 46,XY,r(22)(::pl l->ql3::)). Спермиологическое исследование выполнено у 37 пациентов со структурными мутациями хромосом (табл. 3). Различные формы патозооспермии диагностированы у 36 (97 %) пациентов: азооспермия — у 8 (21 %), криптозооспермия — у 1 (3 %), олигоастенотератозооспермия тяжелой степени — у 18 (46 %), астенотератозооспермия — у 8 (21 %). У 1 пациента с робертсоновской транслокацией (13; 14) определена нормозооспермия. При молекулярно-генетическом исследовании у 11 (19 %) из 58 пациентов 2-й группы обнаружено сочетание структурных мутаций хромосом с другими генетическими факторами бесплодия (микроделеции Y-хромосомы, мутации гена CFTR и «коротких» или «длинных» CAG-повторов гена AR). У одного мужчины с робертсоновской транслокацией установлено наличие полной делеции региона AZFc (del b2/b4) Y-хромосомы (табл. 4). Частичные микроделеции региона AZFc (del b2/b3, del gr/gr) выявлены у 6 (14,3 %) пациентов (от общего числа пациентов с транслокациями) и у 1 пациента с инверсией. Сочетание структурных перестроек хромосом и мутаций или аллели 5Т гена CFTR выявлено у 3 (3,5 %) пациентов. Таким образом, у пациентов с сочетанием хромосомных и генных мутаций выявлены преимущественно тяжелые формы патозооспермии (азооспермия, олигозооспермия тяжелой степени). Сперматологическая характеристика мужчин с нарушением репродуктивной функции, имеющих нормальный кариотип (3-я группа). К данной группе отнесены пациенты, обратившиеся по поводу первичного бесплодия, у которых в ходе цитогенетического исследования не обнаружено хромосомных аномалий. В нее вошли 200 мужчин с различными формами патозооспермии или нарушения сперматогенеза и нормальным мужским кариотипом (46,XY). В структуре спермиологических заключений у 186 (93 %) пациентов 3-й группы отмечена азооспермия, криптозооспермия или олигозооспермия тяжелой степени, у 13 (6,5 %) — астено-/тератозооспермия или олигозооспермия умеренной степени. У 1 пациента выявлена нормозооспермия (см. рисунок). При молекулярно-генетическом исследовании у 56 (28,7 %) пациентов 3-й группы диагностированы различные генетические факторы мужского бесплодия (табл. 5). Полные делеции одного AZF-региона (a, b или с) обнаружены у 19 (34 %) мужчин 3-й группы. У 5 (9 %) пациентов выявлены делеции AZFb+c, в том числе у 1 — в сочетании вариантом IVS8-5T гена CFTR в гетерозиготном состоянии (см. табл. 5).У 1 (1,8 %) пациента диагностирована мутация F508del гена CFTR. Мутации в гене CFTR в компаундгетерозиготе с вариантом IVS8-5T выявлены у 2 (3,6 %) пациентов с обструктивной формой азооспермии (генотипы 2184insA/N,5Т/7Т и F508del/N,5T/9T). У 2 мужчин обнаружено сочетание варианта IVS8-5T гена CFTR и увеличенное количество CAG-повторов гена AR (генотипы CFTR 5Т/7Т; AR CAGn = 28 и CFTR 5Т/7Т; CAGn = 33). Как можно видеть из табл. 5, среди генетических факторов (AZF, CFTR и AR) чаще всего отмечены микроделеции региона AZFc, выявленные у 23 (41 %) пациентов 3-й группы. У 3 мужчин определены частичные делеции региона AZFc (del b2/b3), которые сочетались у одного пациента с повышенным (т = 30) количеством CAG-повторов гена AR, а у 2 — с вариантом IVS8-5T гена CFTR в гетерозиготном состоянии. Сочетание нескольких различных генетических факторов, связанных с нарушением фертильности у мужчин, выявлено у 6 (10,7 %) пациентов 3-й группы. В выявленных случаях сочетания генетических факторов мужского бесплодия во всех 3 группах преобладали тяжелые формы патозооспермии (азооспермия, олигоастенотератозооспермия тяжелой степени), которые выявлены соответственно у 100, 70 и 94,5 % пациентов 1, 2 и 3-й групп (табл. 6). У мужчин с сочетанием генетических факторов бесплодия не обнаружено изолированной тератозооспермии и нормозооспермии. Обсуждение В данном исследовании впервые изучены сочетания различных генетических факторов, связанных с нарушением мужской фертильности (AZF, CFTR, AR), у мужчин с нормальным кариотипом и с хромосомными мутациями (с числовыми и структурными аномалиями). В группе пациентов с числовыми аномалиями хромосом встречали частичные AZF-делеции, изменение количества CAG-повторов гена AR и не встречали полные делеции региона AZF, мутации в гене CFTR. У пациентов со структурными перестройками хромосом выявлены частичные AZF-делеции, мутации в гене CFTR, но не обнаружены «короткие» и «длинные» CAG-повторы гена AR. Это может указывать на то, что наличие у пациента 2 генетических причин мужского бесплодия (например, хромосомной мутации и полной делеции региона AZF) является случайным, встречается редко, и, очевидно, эти генетические факторы не зависят друг от друга. У мужчин с бесплодием, не имеющих аномалий кариотипа, частота других исследованных генетических факторов, нарушающих сперматогенез (AZF, CFTRnAR), примерно в 2 раза превысила совокупную частоту данных факторов в группах пациентов с числовыми и структурными аномалиями хромосом. У пациентов с нормальным кариотипом сочетания микроструктурных перестроек Y-хромосомы и генных вариантов (в генах CFTR и AR) обнаружены чаще, чем у пациентов с хромосомными аномалиями. Сочетание 2 изменений в одном и том же факторе — мутации и аллели 5Т в гене CFTR — может вызывать синдром CBAVD или обструктивную азооспермию. Примечательно, что в структуре патозооспермии обследованных групп нами выявлено сходство.В частности, азооспермию у мужчин с нормальным кариотипом и мужчин с хромосомными аномалиями регистрировали с одинаковой частотой — 58 %. Наличие дополнительных генетических факторов, очевидно, существенно не влияло на тяжесть нарушения сперматогенеза у пациентов с синдромом Клайнфельтера, у которых в основном диагностирована азооспермия. У мужчин со структурными аномалиями чаще обнаруживали олигозооспермию тяжелой степени. Больше всего сочетаний генетических факторов, приводящих к тяжелым формам патозооспермии, выявлено у пациентов с нормальным кариотипом. Наличия полной делении AZF-регионa(oB), мутаций в генах AR или CFTR достаточно для развития тяжелых генетически обусловленных форм мужского бесплодия, как правило первичного. Для данных микроделеций Y-хромосомы характерно тяжелое угнетение сперматогенеза, вплоть до синдрома наличия только клеток Сертоли и секреторной азооспермии, криптозооспермии или олигозооспермии тяжелой степени. Наличие в генотипе мутаций или аллели 5Т в гене CFTR может приводить к развитию синдрома CBAVD, проявляющегося первичным бесплодием вследствие обструктивной формы азооспермии. Следует подчеркнуть, что наличие частичных микроделеций AZFc-региона, только 1 мутации или аллели 5Т гена CFTR, увеличенное или уменьшенное количество CAG-повторов в гене AR не сами по себе вызывают мужское бесплодие, а только в сочетании с другими факторами, поскольку нарушение фертильности имеет мультифакторную этиологию. Их чаще отмечают у мужчин с тяжелыми формами патозооспермии, в частности с азооспермией и олигозооспермией тяжелой степени, однако они встречаются у мужчин с различной фертильностью и показателями спермограммы. Заключение. Данное исследование свидетельствует, что у пациентов с бесплодием может наблюдаться сочетание 2 и более разных генетических факторов, влияющих на мужскую фертильность. Подобные сочетания генетических факторов в генотипе (в частности, микроделеций Y-хромосомы, мутаций гена CFTR и увеличенного числа CAG-повторов гена AR) могут чаще встречаться у пациентов с бесплодием. Если они выявляются в комбинации друг с другом, это производит аддитивный эффект, усиливает негативное действие каждого, утяжеляет клинические (фенотипические) проявления. Дальнейшее изучение данного вопроса очень важно как для понимания причин мужского бесплодия, выбора адекватной тактики лечения, в том числе с помощью вспомогательных репродуктивных технологий, так и для планирования профилактики генетических нарушений у потомства.

Авторы:

Издание: Андрология и генитальная хирургия
Год издания: 2018
Объем: 12с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.40-51. Библ. 12 назв.
Просмотров: 689