Молекулярные механизмы глюкозамина сульфата при лечении дегенеративно-дистрофических заболеваний суставов и позвоночника: результаты протеомного анализа

Аннотация:

Цель исследования — систематический анализ молекулярных механизмов действия хондропротектора Сустагард® Артро, производимого на основе микрокристаллической фармацевтической субстанции глюкозамина сульфата — ГС (Биоиберика, С.А.У., Испания). Систематический анализ молекулярных механизмов на основе данных литературы и протеомных баз данных посредством систем машинного обучения. В результате ГС взаимодействует с рецепторами CD44, TLR4 и ICAM1 на поверхности хондроцитов, ингибирует провоспалительный транскрипционный фактор NF-кВ, цитокиновый сигнальный путь JAK/STAT, регулирует синтез IgA, миграцию лейкоцитов, активность рецепторов гематопоэтина и интерферонов. Заключение. Полученные результаты указывают на молекулярные механизмы синергизма между глюкозамином и нестероидными противовоспалительными препаратами в терапии патологии хрящевой соединительной ткани. Перспективным направлением терапии дегенеративных заболеваний позвоночника является использование хондропротекторов, которые способствуют восстановлению баланса между процессами синтеза и деградации компонентов хряща. Нарушение кровоснабжения, повышенная интенсивность системного воспаления, дефицит гиалуроновой кислоты, глюкозамина и хондроитина сульфата (ХС) приводят к дегенеративной патологии суставов и позвоночника. ХС и глюкозамин вырабатываются хондроцитами и являются одними из основных структурных компонентов хряща и синовиальной жидкости. Глюкозамин - моносахарид, необходимый для синтеза ХС (рис. 1). Недостаток глюкозамина в синовиальной жидкости ухудшает ее качество и может вызвать так называемый хруст в суставах. Глюкозамина сульфат (ГС) — важный нутриент; рекомендуемый уровень ГС для взрослых, установленный в Российской Федерации в нормах по потреблению микронутриентов, составляет не менее 700 мг/сут. С фармакологической точки зрения ГС является корректором метаболизма костной и хрящевой ткани и относится к группе «Прочие нестероидные противовоспалительные и противоревматические средства» (М01АХ по АТХ). Клиническая эффективность препаратов ГС и ХС обусловлена тем, что эти соединения не только являются «строительным материалом» для синтеза гликозаминогликанов хряща, но и проявляют анальгетическое и противовоспалительное действие — фармакологические эффекты, которые весьма трудно объяснить только с позиций «строительного материала». Понимание молекулярных механизмов действия и ГС, и ХС принципиально важно для повышения безопасности и эффективности терапии. В настоящей работе представлены результаты систематического анализа молекулярных механизмов воздействия ГС, результаты протеомных исследований эффектов ГС, данные о фармакокинетике и фармакологической безопасности препаратов на основе субстанции ГС производства Биоиберика, С.А.У. (Испания). Для оценки реального масштаба воздействия ГС на организм человека следует рассмотреть эффекты молекулы в постгеномной перспективе, т. е. в рамках воздействия на геном (совокупность всех генов организма), транскриптом (совокупность всех РНК), протеом (совокупность всех белков) и метаболом (совокупность всех метаболитов). ГС не взаимодействует ни с геномной ДНК, ни с РНК транскриптома, а продукты биотрансформации ГС являются просто отдельными метаболитами из метаболома. Таким образом, фармакологические эффекты ГС опосредуются исключительно взаимодействием с определенными белками протеома (рис. 2). Проведенный нами анализ протеома человека (NCBI PROTEIN, EMBL, UNIPROT, Human Proteome Map, HPM, BIOCYC-HUMAN и др.) показал, что в протеоме человека присутствуют 40 белков метаболизма ГС и 15 таргетных белков ГС, на активность или уровень которых оказывает непосредственное воздействие молекула ГС. Цель настоящей работы — системно-биологический анатаз этих белков и сравнение полученных данных с результатами экспериментальных и клинических исследований. Материал и методы. Списки из 40 белков метаболизма ГС и 15 таргетных белков для исследуемой субстанции ГС, составленные на основе имеющихся аннотаций генома человека в базах данных NCBI PROTEIN, EMBL, UNIPROT и HPM, анализировались посредством метода функционального связывания — одной из информационных технологий современной биоинформатики. Данный метод основан на системном рассмотрении органов, тканей, клеток и их мельчайших компонентов — белков, ДНК, метаболитов (в том числе витаминов и других микронутриентов) в рамках фундаментальных основ молекулярной биологии и биохимии. Так, на основе информации определенной геномной ДНК синтезируется соответствующий белок, выполняющий строго очерченный круг специфических функций. Как врожденные мутации гена, так и дефицит различных микронутриентных кофакторов белка будут приводить к падению активности тех или иных белков и проявлению той или иной специфической симптоматики. Метод анализа функциональных взаимосвязей на основе объединения различных уровней информации (данные о моногенных заболеваниях, кофакторах белков, клеточных ролях белков, симптоматике и критериях диагностики заболеваний и т. д.) в различных базах позволяет систематически рассмотреть возможные биологические роли ГС. В целом при использовании метода анализа функциональных взаимосвязей (рис. 3) каждый белок протеома человека представлен строкой в списке, включающем такие описания белка/гена, как: аминокислотная последовательность белка; список эссенциальных кофакторов белка; список моногенных заболеваний, связанных с полной или частичной потерей активности этого белка и соответствующего гена; список клинических симптомов рассматриваемых моногенных заболеваний; список клеточных функций белка (по базе данных Gene Ontology, GO) и др.); список отдельных симптомов заболеваний, список диагнозов по МКБ-10 и др. Далее в этом списке выделяются гены, соответствующие белкам из списка ГС-зависимых белков и др., и проводятся последующие анализы биологических ролей этих белков на основании статистических критериев. Для статистической обработки результатов исследования применялись методы математической статистики, включающие расчет числовых характеристик случайных величин, проверку статистических гипотез с использованием параметрических и непараметрических критериев, корреляционного и дисперсионного анализа. Сравнение прогнозируемых и наблюдаемых частот встречаемости исследуемых признаков проводилось с помощью критерия критерия Вилкоксона—Манна—Уитни и теста Стьюдента. Для статистической обработки материала использовались прикладная программа Statistica 6.0 и электронные таблицы Microsoft Excel. В результате проведенного анализа среди известных 50 057 белков протеома человека было выделено 20 540 аннотированных белков протеома (т. е. белков, для которых известны хотя бы основные биологически роли). Среди этих 20 540 белков найдено 40 белков метаболизма ГС. Мы выделили 15 таргетных белков ГС, посредством которых осуществляются его основные фармакологические эффекты (см. таблицу). Анализ аннотаций 15 таргетных белков ГС по международной номенклатуре GO показал, что в данной группе белков достоверно чаще встречаются такие биологические функции, как «Внеклеточное пространство (00:0005615)» (белки внеклеточного матрикса), «Воспалительный ответ (G0:0006954)», «Интегральная составляющая плазматической мембраны (G0:0005887)», «Позитивное регулирование каскада ERK1 и ERK2 (G0:0070374)» (сигнальный каскад выживания и роста клеток) и др. (см. рис. 3). В соответствии с результатами биоинформационного анализа протеома и фундаментальных исследований основной молекулярный механизм противовоспалительного действия ГС — ингибирование транслокации внутрь клеточного ядра транскрипционного фактора NF-кВ, который является одним из центральных медиаторов воспаления во всех типах клеток. Подобно ХС, ГС ингибирует эффекты провоспалительного белка NF-kB посредством связывания с центральным таргегным белком ГС — рецептором CD44. Взаимодействуя с белком CD44, ГС активирует внутриклеточные сигнальные процессы и влияет на синтез других белков протеома. Основное отличие между фармакологическими эффектами ГС и ХС заключается в том, что ХС осуществляет медленное, пролонгированное действие, а применение ГС позволяет достигать быстрого эффекта (это прежде всего снятие воспаления и обезболивание). Результатом нашей работы было также установление различий в фармакологических эффектах ГС и ХС. Молекула ГС уже является готовым моносахаридом и не нуждается в переработке на более мелкие единицы. Поэтому молекулы ГС быстро просачиваются в синовиальную жидкость и соединительнотканную структуру хряща и повсеместно активируют рецепторы CD44. Исходно малым размером молекул ГС и объясняется быстрое действие субстанции ГС на воспаление и снятие боли. ГС препятствует осуществлению эффектов провоспалительных цитокинов (прежде всего ФНОа; рис. 4). Дополнительно активация молекулой ГС рецептора CD44 приводит к снижению избыточной активности ММП, в том числе за счет регуляции транскрипции соответствующих генов. Обсуждение. В эксперименте показано, что ГС и ХС действительно снижают уровни биомаркеров воспаления ИЛ1, ИЛ6 и СРВ. ГС способствует дифференциации остеобластов и может увеличивать активность щелочной фосфатазы, синтез коллагена, секрецию остеокальцина и минерализацию. Кроме того, ГС проявляет противовоспалительный эффект за счет уменьшения синтеза ФНОа, ИЛ1бета и простагландина Е2 в макрофагах, что тормозит резорбцию кости. В эксперименте на культуре остеоартритических хондроцитов микрокристаллический ГС дозозависимо и достоверно ингибирует активность фактора NF-kB и транслокацию обеих типов субъединиц NF-kB (р5() и р65) внутрь клеточного ядра. При этом противовоспалительные эффекты ГС наиболее выражены на фоне стимулирования клеток провоспалительным ИЛ. Параллельно ГС ингибирует экспрессию гена СОХ2, кодирующего фермент циклооксигеназу 2 (ЦОГ2), синтез самого белка ЦОГ2 и простагландина Е2. При этом влияния ГС на синтез белка ЦОГ1 не отмечено. Протеомные исследования позволили установить и другие молекулярные механизмы противовоспалительного действия ГС. Так, ГС снижает экспрессию генов, индуцированных ИЛ1бета (в частности, за счет ингибирования активации фактора транскрипции NF-kB). Фармакопротеомное исследование ГС у здоровых добровольцев выявило изменения в экспрессии 31 белка. В результате приема ГС достоверно изменилась экспрессия белков, вовлеченных во внутриклеточную передачу сигнала (11 из 31, или 35%), поддержку окислительно-восстановительного потенциала, ответную реакцию на стресс (15%), синтез и свертывание белков (25%). Другое фармакопротеомное исследование эффектов приема ГС (1500 мг/сут) и ХС (1200 мг/сут) здоровыми добровольцами указало на снижение активности провоспалительных цитокиновых сигнальных путей по сравнению с плацебо (Р=10-16). Кроме сигнального пути NF-kB, в фармакопротеомных исследованиях определены и другие сигнальные пути, которые активируются под воздействием ГС и регулируют процессы воспаления: 1) JAK/STAT (сигнальный путь для осуществления эффектов различных цитокинов); 2) синтез IgA в кишечнике (первая линия защиты против микроорганизмов в слизистой оболочке кишечника); 3) регуляция трансэндотелиальной миграции лейкоцитов; 4) связывание рецепторов гематопоэтина/интерферонов повышение секреции компонентов внеклеточного матрикса соединительной ткани (коллаген, аннексии, тенасцин, аггрекан); 6) возрастание уровня факторов роста соединительной ткани (PENК, CTGF); 7) снижение содержания протеаз, деградирующих соединительную ткань (SERPINA3, SERPIN1). Клинические исследования подтверждают, что пероральный прием ГС способствует уменьшению уровня провоспалительных маркеров в крови. Прием ГС (1500 мг/сут) и ХС (1200 мг/сут) в группе взрослых испытуемых 20—55 лет (n=18) с избыточной массой тела и ожирением (ИМТ 2532 кг/м2) в течение 28 дней приводил к падению уровня СРВ на 23% по сравнению с плацебо (р=0,048). В другом исследовании прием ГС + ХС сопровождался снижением абнормально повышенных уровней СРВ на 28-36% и окислительного стресса на 40-47% (n=220). В популяционном исследовании, включавшем 10 000 взрослых пациентов, регулярное использование ГС + ХС также было ассоциировано со снижением уровня СРВ (на 20%). Псроральный прием ГС и ХС помогает восстановить структуру хряща (например, сочленяющиеся суставные поверхности при остеоартрите - OA). Сочетанный прием ГС и ХС снижает концентрацию провоспалительных цитокинов, усиливает структуру гелевой основы хряща, предотвращает дегенерацию коллагена в суставах (в частности, за счет ингибирования гидролитических ферментов). Эти эффекты ГС/ХС облегчают боль и позволяют частично восстановить функцию сустава у пациентов с OA. Хондроциты используют ГС в качестве «строительного материала» для синтеза гелевого компонента внеклеточного матрикса. ГС всасывается хондроцитами посредством специальных транспортных каналов типа SLC2A. При избыточной активации хондроцитов провоспалительным ИЛ 1бета происходит активация многих механизмов поддержки воспаления. Ечюкозамин снижает интенсивность провоспалительного отклика при стимуляции хондроцитов ИЛ 1бета. Известны следующие эффекты глюкозамина: а) ингибирование синтеза ЦОГ2 и ИЛ6; б) восстановление синтеза протсогликана, сниженного при воздействии ИЛ 1бета; в) торможение активации провоспалительного сигнального белка NF-kB и его транслокации в ядро. Эффективность ГС при OA была оценена в метаанализе, включавшем 19 рандомизированных плацебоконтролируемых испытаний (n=3159). Прием ГС приводил к уменьшению симптомов заболевания на 22% (95% ДИ от -48 до +4); в подвыборке исследований, в которых длительность приема ГС составила более 6 мес, отмечено уменьшение симптомов на 36% (95% ДИ от -56 до -17). Поскольку и ГС, и ХС воздействуют на процессы воспаления, их сочетание с другими противовоспалительными средствами может давать синергичный эффект. Так, сочетанный прием ГС с омега-3-полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК) способствует улучшению состояния пациентов с умеренным и тяжелым OA бедренного и/или коленного сустава. В крупномасштабном российском исследовании (38 центров, 4931 пациент 57±12 лет, 75% женщин) было показано, что при использовании сочетания ГС с нестероидными противовоспалительными препаратами (НПВП) оценка тяжести боли у пациентов с OA снижалась с 0,7±0,2 у. е. в начале исследования до 0,2+0,2 у. е. через 8 нед (р<0,001). Использование НПВП в высоких дозах длительными курсами зачастую осложняется поражением желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), нарушением свертывания крови, патологией почек (отеки). Кроме того, применение НПВП является симптоматическим лечением, так как воздействует только на факторы воспаления. Реконструктивная терапия хряща с использованием ГС/ХС стала массово применяться в течение последних 10-15 лет. В рандомизированном исследовании было показано, что прием ГС + ХС в течение 6 мес существенно уменьшает симптомы OA колена (боль, скованность, ограничение подвижности) и сопоставим по эффективности с приемом НПВП (целекоксиб). Пациенты были рандомизированы на получение 500 мг ГС + 400 мг ХС три раза в день или 200 мг целекоксиба ежедневно. Через 6 мес терапии среднее изменение боли по шкале WOMAC составило -186 баллов (95% ДИ от -200 до -171) в группе принимавших ХС + ГС и -187 баллов (95% ДИ от -202 до -172) в группе леченных целекоксибом (р=0,92). В обеих группах отмечено уменьшение отека суставов на 50%. Схожие результаты были получены и для других НПВП. При лечении пациентов с OA височно-нижнечелюстного сустава ГС оказался эффективнее, чем повсеместно используемый НПВП ибупрофен. Оценка эффектов ГС и ибупрофена проводилась у 60 пациентов (средний возраст — 27±11 лет), 30 из которых получали 400 мг ибупрофена два раза в день, а другие 30 пациентов — 1500 мг/сут ГС. В обеих группах отмечены достоверное уменьшение болевого синдрома (р<0,0001) и улучшение подвижности нижней челюсти (р<0,001 для ГС и р<0,03 для ибупрофена). При этом эффект был более выражен при использовании ГС. Комбинация ГС и ХС способствует снижению уровня простагландина Ез в синовиальной жидкости. Рандомизированное исследование включало 31 пациента с болезненностью в суставах и смещением диска (по данным магнитно-резонансной терапии — МРТ). Пациентам назначали комбинацию 1500 мг/сут ГС и 1200 мг/сут ХС, в то время как в контрольной группе использовали трамадол (50 мг/сут). Через 8 нед отмечено достоверное снижение уровня простагландина Е2 в группе ХС + ГС. В фармакокинетических исследованиях установлено, что доза ГС 1500 мг является оптимальной. В открытом рандомизированном перекрестном исследовании 12 здоровых добровольцев получали микрокристаллический ГС (однократно, в дозах 750; 1500 и 3000 мг). Время полувыведения глюкозамина составило в среднем 15 ч. Фармакокинетические кривые показали, что после перорального приема ГС быстро всасывается и его фармакокинстика линейна в диапазоне доз 750—1500 мг. При использовании дозы 3000 мг линейная пропорциональность между принимаемой дозой и концентрацией ГС в плазме нарушалась, и концентрация была меньше ожидаемой. Иначе говоря, отклик концентраций ГС в крови при повышении дозы от 1500 до 3000 мг увеличивается не в два раза (как ожидалось бы при линейной пропорциональности), а всего в 1,4—1,6 раза (т. е. при дозах >1500 мг наблюдается плато, или насыщение, всасывания ГС). При использовании стандартной дозы 1500 мг уровень ГС в плазме увеличивался в 30 раз по сравнению с исходным и достигал примерно 10 мкмоль/л. Важно отметить, что терапия глюкозамином (который является производным глюкозы) безопасна с точки зрения формирования инсулинрезистентности и нарушений липидного профиля. Прием глюкозамина в дозе 1500 мг/сут здоровыми добровольцами (n=19) в течение 12 нед не провоцировал развития глюкозотолерантности. Долгосрочное применение ГС при лечении OA не оказывает нежелательного воздействия на артериальное давление (АД), уровни липидов и глюкозы крови. Прием ГС в течение 6—36 мес в рандомизированных контролируемых испытаниях (n=428) не приводил к существенным изменениям АД по сравнению с плацебо (систолическое АД — 5±15 мм рт. ст., диастолическое АД — 5+10 мм рт. ст.). Уровни общего холестерина, липопротеинов высокой плотности и глюкозы в крови также не изменялись во время курса терапии. Эти данные подтверждают высокую сердечно-сосудистую безопасность ГС при долговременном приеме. Высокоочищенная кристлизированная субстанция ГС (производства Биоиберика, С.А.У., Испания), лежащая в основе препарата Сустагард® Артро (порошок для приготовления раствора для приема внутрь), более эффективна, чем другие формы ГС и тем более глюкозамина гидрохлорида. В эксперименте подтверждено, что комбинация кристаллизированного ГС и ХС из экстракта трахеи быка снижала экспрессию гена ЦОГ2 и синтез простагландина Е. Долговременный прием субстанции (12 мес и более) задерживает развитие структурных нарушений суставов, позволяет снизить потребность в обезболивающих средствах и необходимость замены сустава в течение 5 лет после окончания курса терапии. Прием кристаллизированной субстанции ГСperos (1500 мг/сут, курс — 2,5 года) пациентками (n=407) в возрасте 50—60 лет с избыточной массой тела (ИМТ>27 кг/м2) позволил снизить риск развития OA в 2,4 раза (ОР - 0,41; 95% ДИ - 0,20-0,85; р=0,02). Заключение. Как и эссенциальные микронутриенты (витамины, омега-З-ПНЖК, селен и др.), глюкозамин входит в метаболом человека. «Выпадение» глюкозамина из диеты или нарушение его всасывания в ЖКТ нарушает состояние метаболома и будет ускорять различные патофизиологические пути деградации хряща и других видов соединительной ткани (мочевого пузыря, лоханок, кровеносных сосудов, соединительной ткани мозга и др.). Проведенный систематический анализ позволил выделить ключевые молекулярные механизмы действия препарата Сустагард® Артро на основе высокоочишенной кристаллической субстанции ГС. Потенциальные таргетные белки кристаллической субстации ГС (n=15) участвуют в метаболизме внеклеточного матрикса соединительной ткани, воспалительном ответе, модуляции передачи сигнала от факторов роста. ГС взаимодействует с рецептором CD44 на поверхности хондроцитов и затем ингибирует провоспалительный транскрипционный фактор NF-кВ. Кроме того, ГС также воздействует на цитокиновый сигнальный путь JAK/STAT, синтез IgA, регулирует миграцию лейкоцитов и активность рецепторов гематопоэтина/интерферонов, увеличивает синтез компонентов хряща (т. е. оказывает разностороннее хондропротекторноe действие). Таким образом, ГС, как и ХС, при воздействии на хондроциты пациентов с OA является не только «строительным материалом» хряща. ГС, действуя синергично с молекулами ХС, повышает синтез компонентов соединительной ткани хряща и в то же время снижает активность процессов деградации этой вновь образованной ткани (рис. 5). При этом ГС начинает действовать намного раньше, чем ХС, оказывая быстрый противовоспалительный и обезболивающий эффект. Высокоочищснные и стандартизированные фармацевтические формы ГС и ХС производства Биоиберика, С.А.У. (Испания) не только эффективны с точки зрения доказательной медицины, но и безопасны в плане побочных эффектов. Как хондропротектор комбинация ГС + ХС имеет доказательность класса А для лечения OA коленного и тазобедренного сустава и по эффективности сравнима с НПВП. Отметим, что ГС и НПВП дополняют эффекты друг друга, что может существенно улучшать результаты терапии.

Авторы:

Издание: Неврология, нейропсихиатрия, психосоматика
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.38-44. Библ. 34 назв.
Просмотров: 148