ОПРЕДЕЛЕНИЕ ДОЛИ ИНФИЦИРОВАННЫХ ВИРУСОМ БЕШЕНСТВА КЛЕТОК ЛИНИИ VERО С ПОМОЩЬЮ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕТРИИ

Аннотация:

Экспериментальное обоснование возможности определения в культуре доли инфицированных вирусом бешенства клеток линии Vero с использованием проточной цитометрии (ПЦ) и диагностического антирабического иммуноглобулина (ДАИ), меченного ФИТЦ (ВНИИЗЖ, г. Владимир). Фиксацию и пермебиализацию клеток Verо, инфицированных вирусом бешенства «Москва 3253», проводили с помощью реагента Сytofiх/Сytoperm (ВD Вiosiences, ША) по методу Vengatesan D. еt аl. (2006). и внутриклеточный антиген окрашивали ДАИ. Процент инфицированных клеток определяли с помощью ПЦ через 24, 48 и 72 ч., а также через 48 ч при инфицировании клеточных культур десятикратными разведениями вируссодержащей жидкости от 10' до 10-8. Доля инфицированных клеток возрастала в промежутке времени от 24 до 48 ч в среднем с 30 до 70%. При добавлении к клеткам вируссодержащей жидкости в разведении 10 3 методом ПЦ обнаружено 6,9 ± 0,21 % инфицированных клеток Уего (Р<0,001, n=3). ПЦ проявила себя как быстрый, чувствительный и надёжный метод определения относительного числа инфицированных вирусом бешенства клеток Verо. Препарат ДАИ обладал активностью, достаточной для его эффективного использования в автоматизирован ном варианте постановки М ФА на базе метода ПЦ. Использование ПЦ возможно на различных этапах производства и контроля антирабических препаратов. Вирус бешенства относящийся к семейству КНаЬсклтпёае и роду 1_у8заУ1Ш8, вызывает у человека и животных опасное инфекционное заболевание, наносящее ущерб экономике и здравоохранению. На территории Российской Федерации с 1 января 2015 г. действует межгосударственный стандарт диагностики бешенства, согласно которому выделение вируса осуществляют в культуре клеток мышиной нейробластомы. Детекцию вируса бешенства в инфицированных клетках (И К) проводят методом флуоресцирующих антител (МФА), и результат учитывают с помощью люминесцентной микроскопии. Указанная схема лабораторной диагностики бешенства представляет собой альтернативу биопробе на белых мышах. Люминесцентную микроскопию широко используют также для определения активности вируса и антирабиче-ских сывороток в тестах т уНго, подразумевающих использование клеточных культур и рекомендуемых Всемирной Организацией Здравоохранения и Всемирной Организацией по охране здоровья животных. Однако классический вариант постановки МФА с использованием люминесцентной микроскопии характеризуется длительностью, трудоёмкостью и субъективностью. Он не способен точно определять относительное число инфицированных вирусами клеток, в отличие от автоматизированного варианта количественной оценки реакции иммунофлуоресценции на основе технологии импульсной проточной цитометрии (ПЦ). Применение ПЦ в микробиологии — это путь к дальнейшему совершенствованию диагностики инфекционных болезней, и в зарубежной печати имеются сообщения о детекции с помощью ПЦ вируса бешенства в кульгурах клеток мышиной нейробластомы (1У^А), почки сирийского хомяка (ВНК-21) и глиомы крыс (С6). Клетки почечного эпителия зелёной мартышки (Уего) нашли применение для обнаружения методом ПЦ опасных для людей вирусов Эбола, Денге и Зика, но не для детекции в них вируса бешенства. Тем не менее, перевиваемую клеточную линию Уего успешно используют для культивирования вируса бешенства в России, где ПЦ для обнаружения вирусов в инфицированных клеточных культурах еще не применялась. На сегодняшний день отсутствует также информация о возможности использования выпускаемых в России препаратов диагностических антирабических флуоресцирующих антител в автоматизированном варианте постановки МФА на базе ПЦ анализа. Целью настоящей работы явилось экспериментальное обоснование возможности определения в культуре доли инфицированных вирусом бешенства клеток линии Уего с использованием ПЦ и выпускаемого в России диагностического флуоресцирующего антирабического иммуноглобулина. В работе использовали клеточную линию Уего, полученную из коллекции ООО «Биолот» (Санкт-Петербург), а также аттенуированный штамм вируса бешенства «Москва 3253», полученный из коллекции Научного центра экспертизы средств медицинского применения (Москва). Клетки Уего культивировали на среде Игла МЕМ с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота («Биолот», Россия). Инфекционный титр вируса для клеточной линии Уего предварительно определяли на 96-луночных планшетах. В каждую лунку с серийными четырехкратными разведениями вируссодержащей суспензии добавляли по 100 мкл среды, содержащей 1,2 — 2,0 х 104 клеток Уего. Клетки инкубировали с вирусом в течение 48 ч при 37°С в 5% СОг, затем фиксировали ацетоном и окрашивали меченным ФИТЦ диагностическим антирабиче-скиуи иммуноглобулином (ВНИИЗЖ, г. Владимир). По результатам учёта фокусов флуоресценции с помощью люминесцентного микроскопа «Микромед И-ЛЮМ» определяли инфицирующую дозу (ИД50). Для цитофлуориметрического анализа клетки Уего, предварительно выращенные в культуральных флаконах с площадью ростовой поверхности 25 см2 до состояния конфлюэнтного монослоя, открепляли от поверхности флакона и ресуспендировали в 5 мл питательной среды, к которой добавляли вирус в исходной дозе 0,3±0,11 1§ ИД50 на клетку. Далее исследовали динамику репродукции вируса бешенства в условиях т уНго путем сбора клеток через 24, 48 и 72 ч культивирования. В качестве контроля использовали интактную клеточную культуру. В следующем эксперименте к клеткам добавляли десятикратные разведения исследуемой вируссодержащей жидкости в пределах от 10"1 до 10"8. Накопление вируса в клетках оценивали через 48 ч после инфицирования клеточной культуры. Фиксацию и пермебиализацию клеток проводили с помощью набора Су1о1тх/Су1орегт (ВО Вюзаепсез, У5А) по методу, разработанному Уеп§а!е8ап Р. е1 а1. для детекции вируса бешенства с помощью П Ц в И К мышиной нейробластомы. Иммунофлуоресцентное окрашивание антигена в клеточной цитоплазме осущест вляли конъюгированным с ФИТЦ диагностическим анти-рабическим иммуноглобулином. Для исследований методом ПЦ использовали рабочее разведение указанного диагностического препарата, аналогичное используемому разведению в экспериментах с применением люминесцентной микроскопии и соответствующее рекомендациям производителя. Образцы анализировали со скоростью около 500 клеток в секунду на ПЦ СуАп АОР ОакоСу1ошаПоп с аргоновым лазером мощностью 20 т\У при длине волны эмиссии 488 нм. При создании протокола анализа с использованием программного обеспечения 5иттк 4.3 ВиШ 2445 настройки устанавливали таким образом, чтобы на цитограммах по параметрам интенсивности прямого (Р5) и бокового (58) светорассеяния неповреждённые живые клетки Уего отличались от клеточного дебриса и погибших клеток с характерными изменениями клеточного размера и внутриклеточной структуры. Область интенсивности флуоресценции, соответствующую ИК, идентифицировали в окне Бо1 Р1о1 58/Р1ТС РЬ путём повышения высоковольтного напряжения на фотодетекторе до величины 340 В. Значения интенсивности флуоресценции в данной области составили более 10 условных единиц (каналов). Долю И К определяли как процентное отношение числа клеток, зарегистрированных в этой области, к общему числу исследованных клеточных элементов. Более того, из частотных распределений отдельных клеток по интенсивности их специфической иммунофлуоресценции оценивали в области, соответствующей И К, среднюю внутриклеточную вирусную нагрузку (Меап) в используемых условных единицах измерения и определяли коэффициент вариации (СУ, в %), отражающий степень неоднородности фракции ИК по данному параметру. Статистический анализ результатов проводили общепринятыми методами На рис. 1 в виде цитограммы представлено характерное распределение отдельных клеток Уего по объёму (прямое светорассеяние, Рогшагс! 5саИ:ег (Р5) и по степени внутриклеточной гранулярности (боковое светорассеяние, ЗШе 5саИег (55) в инфицированной вирусом культуре. Результат анализа получен через 72 ч инкубации, когда инфицированные культуры были максимально неоднородны по исследуемым клеточным показателям. На цитограмме выделены три характерные области: эллипсовидная область К1, соответствующая нормальным клеткам с исходными морфологическими параметрами; область регистрации погибших клеток с признаками апоптоза и некроза (К4); область, где по значению параметра 88 учитывались клетки с повышенной степенью внутриклеточной гранулярности (К5). Статистический анализ цитограмм показал, что к 72 ч развития инфекции в условиях т уйго штамм фиксированного вируса бешенства повреждал не более 20% клеток Уего (18,6+0,6%, при значении показателя в контроле 2,9+0,3%, Р<0,001, при п=3). Еще слабее повреждающий эффект вируса в культурах клеток линии Уего был через 48 ч (7,8±1,2%, Р<0,05) и отсутствовал на ранней стадии инфицирования, поскольку к 24 ч достоверных различий с контролем по числу погибших клеток не было зарегистрировано. Число клеток с повышенной степенью гранулярности в инфицированных вирусом культурах увеличивалось к 72 ч инкубации до 10,3± 1,1% относительно исходного показателя 3,7±0,9% (Р<0,05) в контроле Иммунофлуоресцентный анализ больших статистических выборок отдельных клеток Уего в инфицированных вирусом культурах проводили в условиях автоматического гейтирования гистограмм по области К.1 (С1:К1). То есть, детекцию вируса бешенства мы проводили только в живых, ещё неповреждённых клетках линии Уего, попадающих по параметрам светорассеяния в элипсовидную область К.1. Гистограмма, представленная на рис. 2 В, иллюстрирует факт присутствия в культуре как инфицированных клеток в количестве 33,98% (в области К2), так и не инфицированных вирусом бешенства клеточных элементов. При исследовании контрольных проб, не содержащих инфицированные вирусом клетки Уего, характерный пик ИК в области К2 отсутствовал (рис. 2 А). Для всех контрольных образцов в наших исследованиях был характерен стабильно очень низкий уровень подсчёта фоновых сигналов флуоресценции в области К2 не более 2% (1,1 ±0,45%, при п=10). Аналогичные значения данного показателя (0,9+0,27%, Р>0,05) имели место при анализе чистых проб с физиологическим раствором или деионизованной водой, когда из проточной системы прибора потоком жидкости в небольшом количестве смывались ранее адсорбированные в ней окрашенные клетки. Через 24,48 и 72 ч в инфицированных культурах регистрировали выраженные достоверные различия по относительному содержанию И К: соответственно 29,5+1,7%, 70,4±2,0 % и 88,3±1,3% (Р<0,001, п=3). Хотя к 24 ч инкубации доля И К была минимальна, именно в этот срок мы регистрировали самую высокую среднюю (Меап) вирусную нагрузку на И К (73,5+1,3 усл. ед. интенсивности специфической иммунофлуоресценции), а также максимальные значения коэффициента вариации (СУ) по данному параметру, равные 115,6+0,8%. Для двухсуточных культур данные показатели были в 1,5 раза ниже — соответственно 51,4+1,6 усл. ед. и 72,3±0,5% (Р<0,001). К 72 ч снова отмечали увеличение вирусной нагрузки на И К до 66,2±0,8 усл. ед., а также значений СУ до 86,1 ± 1,4% (Р<0,05). Факт присутствия специфического антигена в И К подтверждали результаты люминесцентной микроскопии через 24, 48 и 72 ч (данные не представлены). Однако традиционный вариант МФА не позволял определять процентное содержание И К в популяции. С его помощью проведение количественного мониторинга указанного показателя в процессе культивирования не представляется возможным. Детекцию вируса бешенства в клетках линии Уего ПЦ анализ обеспечивал в наших исследованиях при 1000-кратном снижении исходной инфицирующей дозы. Доля ПК была в этом случае 6,9±0,21% (Р<0,001 при п=3). При повышенных исходных вирусных нагрузках 1/100 и 1/10 относительно^.количество ИК в двухсуточных культурах увеличивалось соответственно до 38,5+1,5 и 67,2+0,8%. При дальнейших десятикратных снижениях исходной инфицирующей дозы метод П Ц уже не выявлял вирус бешенства в клетках линии Уего через 48 ч инкубации. Чувствительность классического варианта постановки МФА также позволяла детектировать вирус в клетках Уего при 1000-кратном снижении исходной инфицирующей дозы. Однако в полях зрения люминесцентного микроскопа можно было наблюдать в этом случае только единичные специфически флуоресцирующие клетки. Автоматизация и стандартизация МФА на базе ПЦ технологии позволяет повысить эффективность диагностики инфекционных болезней человека и животных, что уже убедительно доказано в зарубежных исследованиях на примерах детекции различных вирусов, в том числе и вируса бешенства. В настоящей работе впервые на модели клеток линии Уего и штамма фиксированного вируса бешенства «Москва 3253» в России получены результаты, подтверждающие высокую эффективность использования ПЦ как инструмента для мониторинга изменений относительного количества инфицированных вирусами клеток в клеточных культурах, а также установлен характер этих изменений в зависимости от исходной вирусной нагрузки и срока инкубации. Накопление вируса бешенства при его культивировании т уИго зависит от выбора клеточной культуры. С помощью ПЦ установлены различия при исследовании репродукции вируса в культурах клеток МЫА и ВНК-21. Инфицирование вирусом бешенства более 70% клеток ВНК-21 имело место только после 72 ч, в то время как в культурах МNА доля И К резко увеличивалась до 75% уже к 48 ч инкубации. Результаты наших исследований свидетельствуют, что в клетках линии Уего вирус бешенства размножается также быстро, как и в клетках УША. Поэтому с точки зрения чувствительности детекции вируса в клеточных культурах и, как следствие, диагностики бешенства использование клеток Уего представляется не менее эффективным, чем клеток мышиной нейробластомы. Наиболее интенсивное образование новых вирусных частиц в ИК линии Уего регистрировали с помощью П Ц через 24 ч, при этом изменения значений показателей Меап и СУ носили циклический характер. Увеличение числа повреждённых и структурно изменённых клеток с аномальными морфологическими характеристиками к 72 ч инкубации указывает, вероятно, на усиление в этот срок процесса выхода вируса во внеклеточное пространство. Аттенуированный вирус бешенства оказывал на клетки Уего слабый цитопатический эффект, что согласуется с литературными данными. На наш взгляд, определение методом ПЦ относительного содержания клеток, инфицированных вирусом бешенства, позволит повысить точность и эффективность анализов при определении активности вируса и уровня нейтрализующих антирабических антител в сыворотках крови людей и животных, что откроет новые возможности в совершенствовании диагностики бешенства. Препарат диагностического антирабического флуоресцирующего иммуноглобулина, созданный в России для классического варианта МФА с использованием люминесцентной микроскопии, обладает по нашим данным достаточной активностью для его эффективного применения в автоматическом (импульсном) режиме количественного измерения интенсивности клеточной иммунофлуоресценции. Получение точной информации об особенностях культивирования вируса, основанной на результатах количества ИК в культуре, в дальнейшем позволит использовать ПЦ на этапах производства и контроля разрабатываемых и выпускаемых в России антирабических препаратов.

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.18-25. Библ. 15 назв.
Просмотров: 66