ПРИМЕНЕНИЕ УНИВЕРСАЛЬНЫХ ПЛАЗМИДНЫХ КОНСТРУКЦИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛНОРАЗМЕРНЫХ РЕКОМБИНАНТНЫХ АНТИТЕЛ ЗАДАННОЙ СПЕЦИФИЧНОСТИ В ЭУКАРИОТИЧЕСКИХ КЛЕТКАХ

Аннотация:

Разработка методических подходов для изменения антигенной специфичности химерных антител путем замены генов вариабельных областей в полученных ранее универсальных плазмидных конструкциях рLK DТ-17 и рНG DТ-17, кодирующих антитело против дифтерийного токсина (ДТ) DТ-17, на гены антитела, связывающегося с другим эпитопом ДТ — DТ-22. Из гибридомы, продуцирующей моноклональные антитела к ДТ DТ-22, методом обратной транскрипции и ПЦР были получены гены вариабельных областей легких и тяжелых цепей мышиного антитела к ДТ — ОТ-22. Генно-инженерными методами в рекомбинантных плазмидах рLK DТ-17 и рНG DТ-17, кодирующих соответственно легкую и тяжелую цепи антитела ОТ-17, заменяли вариабельные области антител DТ-17 на соответствующие области DT-22. После чего получали «супервектор» рSV DТ-22, содержащий гены обеих цепей химерного антитела. С использованием культуральных методов «супервектором» была трансфицирована культура клеток СНО и получен высокопродуктивный клон, секретирующий химерные антитела к ДТ. Для оценки активности антител применяли иммунохимические и культуральные методы, а для получения препаративного количества антител — аффинную хроматографию. Выход очищенных химерных антител DТ-22, секретируемых клоном, составил 4 мг с 1 л культуральной среды. Минимальная концентрация химерных антител, при которой наблюдалась нейтрализация ДТ в культуре клеток СНО, составила 22 мкг/ мл среды. Таким образом, было показано, как из сконструированных ранее универсальных рекомбинантных плазмид рLK DТ-17 и рНG DТ-17, кодирующих соответственно легкую и тяжелую цепи антитела к ДТ DТ-17, простыми генно-инженерными методами были получены векторы, кодирующие синтез легкой и тяжелой цепей химерного антитела DТ-22, специфичного к другому эпитопу ДТ. Для защиты от чужеродных патогенов иммунная система позвоночных постоянно вырабатывает молекулы иммуноглобулинов. Они представляют собой сложные белковые молекулы, которые способны идентифицировать и нейтрализовать антигены, такие как бактерии, вирусы, токсины, яды и др. Чаще всего для получения антител используют донорскую кровь и кровь иммунизированных животных, но их применение ограничивают различные факторы. Для человеческих антисывороток существует дефицит сырьевой базы донорских сывороток, имеет место сложность стандартизации, а также риск заражения пациента редкими патогенами, например, малоизученными вирусами или прионами. Антисыворотки, полученные от животных, вызывают различные побочные эффекты в виде аллергических реакций вплоть до анафилактического шока или образование собственных антител к белкам сыворотки животного, что существенно снижает эффективность препаратов животного происхождения при длительной терапии. В 1975 году Кёлер и Мильштейн разработали процедуру эффективного производства мышиных моноклональных антител желаемой антигенной специфичности, что положило начало развитию гибридомной технологии. Полученные мышиные антитела не взаимодействовали должным образом с компонентами иммунной системы человека, и их использование было строго ограничено. Достижения в области молекулярной биологии способствовали развитию генетической инженерии, целью которой было создание на основе генов иммуноглобулинов плазмидных конструкций, кодирующих рекомбинантные антитела с заданными свойствами. В зависимости от поставленной задачи стало возможным изменение размеров антител, их специфичности, аффинности, валентности. Открылись перспективы получения мини-антител, химерных и гуманизированных антител, которые широко используются в научных исследованиях и медицине. В настоящее время для клинического применения зарегистрированы более 30 препаратов на основе рекомбинантных антител. Из них около 90% предназначены для лечения онкологических заболеваний, например, рака молочной железы, рака кишечника, В-клеточной лимфоцитарной лейкемии, Неходжкинской лимфомы, миелолейкоза и др. Также антитела используют в трансплантологии, для лечения сердечно-сосудистых, аутоиммунных и, в редких случаях, инфекционных заболеваний. В основе рекомбинантных антител, применяемых в терапии заболеваний человека, лежат генетические конструкции в виде плазмидных векторов, адаптированных для эукариотических систем экспрессии, которые чаще всего создаются под конкретное антитело каждый раз заново, что увеличивает стоимость разработки новых конструкций и повышает трудовые и временные затраты. Ранее были сконструированы и синтезированы последовательности генов легкой и тяжелой цепей химерного антитела, нейтрализующего дифтерийный токсин — ОТ-17, которые были клонированы в эукариотиче-ском векторе рС1-пео («Рготе§а», США). Нуклеотидные последовательности генов вариабельных областей были получены из мышиной гибридомы, секретирующей моноклональные антитела ОТ-17. Особенность сконструированных плазмидных векторов была в том, что каждый фрагмент гена: лидерная, вариабельная и константная области были фланкированы сайтами редкощепящих эндонуклеаз рестрикции. Таким образом, были созданы конструкции, которые потенциально позволяют заменять гены вариабельных и константных областей с целью получения антител другой специфичности, другого класса или видовой принадлежности. Ранее нами также была получена мышиная гибридома ОТ-22, продуцирующая антитела к другому эпитопу дифтерийного токсина (ДТ), чем ОТ-17 и также обладающая токсиннейтрализующей активностью. Целью настоящей работы было получение плазмидных конструкций, кодирующих химерные моноклональные антитела к дифтерийному токсину (ДТ) ОТ-22, на основе полученных ранее универсальных векторов рЬК ОТ-17 и рНС ОТ-17, кодирующих химерные антитела к ДТ ОТ-17, но связывающихся с другим эпитопом, путем замены в векторах генов вариабельных областей ОТ-17 на вариабельные области ОТ-22. В исследовании использовалась гибридома ОТ-22, продуцирующая моноклональные антитела, которые обладают нейтрализующей активностью в отношении дифтерийного токсина. Гибридомы-продуценты антител к дифтерийному токсину культивировали на среде КРМ1 1640 с добавлением 10% сыворотки плода коровы и глутамина. После восстановления криоконсервированных гибридных клонов перед выделением из них мРНК их культивировали при 37°С в СО2 инкубаторе в течение нескольких суток. Морфологию клеток оценивали под инвертированным микроскопом, их антитело-образующую способность и активность антител в культуральной среде — в ИФА. При сохранности специфичных для каждого клона характеристик, клетки, взятые на стадии экспоненциального роста, осаждали центрифугированием; осадок клеток использовали для выделения суммарной РНК с использованием набора реагентов К№а$у М1111 Кй («СНа§еп», Германия). Праймеры для амплификации участков генов, кодирующих вариабельные фрагменты тяжелой и легкой цепей мышиных 1§С, подбирали, руководствуясь. Олигонуклеотиды синтезировали в компании «Синтол» (Россия). Получение кДН К в реакции обратной транскрипции (ОТ), амплификацию доменов вариабельных участков иммуноглобулинов мыши, а также встраивание их в плазмиду, секвенирование ампликонов и плазмиды для контроля правильности полученной конструкции проводили в соответствии со стандартными методами генной инженерии. Культуру клеток СНО культивировали на питательных средах К.РМ1 («Панэко», Россия) или Ор11-МЕМ («1гт1го§еп», США) с добавлением и без добавления фетальной бычьей сыворотки («СНЪсо», США) в количестве 2,5-5%. Для трансфекции клеток использовали реактив ироГес1агтпе 2000 («1гм1го§еп», США) согласно рекомендациям производителя, а для аффинной очистки иммуноглобулинов — протеин-С сефарозу («Биалекса», Россия). Изгибридомы ОТ-22, продуцирующей моноклональные антитела к дифтерийному токсину, выделяли суммарную РНК, в реакции ОТ получали кДНК с использованием олиготимидинового праймера Т18. Для амплификации генов вариабельных областей легкой и тяжелой цепей иммуноглобулина С мыши использовали универсальные праймеры, описанные в. Полученные ПЦР-продукты секвенировали. На основе нуклеотидных последовательностей вариабельных генов легкой (Ь) и тяжелой (Н)-цепей были подобраны праймеры, которые на 5'-концах содержали «довески», включающие в себя сайты рестрикции для клонирования в векторы рЬК ОТ-17 и рНС ОТ-17, полученные ранее и содержащие гены химерного антитела к ДТ (ОТ-17), направленного к другому эпитопу токсина. Полученные таким образом ПЦР-продукты обрабатывали рестриктазами 1Мш] и Взр 131 («СибЭнзим», Россия) для клонирования вариабельной области тяжелой цепи антитела ОТ-22 в вектор рНС ОТ-17и Е§е1, 5Гг2741 («СибЭнзим», Россия) для клонирования вариабельной области легкой цепи каппа в вектор рЬК ОТ-17 (рис. 1). Соответствующими рестриктазами также обрабатывали векторы, избавляясь от вырезаемых вставок I, и Н-цепей вариабельных областей ОТ-17. Для этого обработанные рестриктазами векторы разделяли в агарозном геле, а затем вырезали из геля высокомолекулярные фрагменты, представляющие собой плазмидные векторы без вариабельных участков антител ОТ-17. Затем проводили лигирование вектора с подготовленными ПЦР-продуктами. Так как векторные конструкции рЬК ОТ-17 и рНС ОТ-17 уже содержали в своем составе нуклеотидные последовательности константных областей иммуноглобулина С человека, то их клонировать не требовалось. Для анализа работоспособности полученных рекомбинантных векторов р1Ж ОТ-22 и рНС ОТ-22 в эукариотической системе ими была проведена трансфекция клеток СНО. При проведении трансфекции по отдельности и ко-трансфекции обеими плазмидами был использован реагент для трансфекции УроГесгаггнпе 2000 («1пукго§еп», США), согласно инструкции производителя. Одновременно с трансфекцией был произведен контроль эффективности трансфекции плазмидой рТигЬоКРР-С («Евроген», Россия). На третьи сутки после трансфекции культуральную жидкость отбирали в отдельные пробирки и центрифугировали. Полученные осветленные образцы анализировали методом ИФА. На поверхности планшетов для ИФА был адсорбирован дифтерийный анатоксин. Планшеты обрабатывали 2-кратными разведениями препаратов, полученных в результате трансфекции в трех повторах. После инкубации планшеты промывали и инкубировали с пероксидазным конъюгатом, специфичным к Рс-фрагментам человеческих иммуноглобулинов С, реакцию проявляли ТМВ.

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.32-39. Библ. 8 назв.
Просмотров: 114