Поиск | Личный кабинет | Авторизация |
ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ НУКЛЕОТИДНЫХ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ ГЕНА аrр У РОССИЙСКИХ ИЗОЛЯТОВ ТREPONEMA PALLIDUM
Аннотация:
Анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей внутреннего фрагмента гена аrр у современных российских штаммов Т. pallidum subsh.pallidum. В работе использованы 57 клинических изолятов, полученных в 2016 — 2017 гг. из специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля Центрального (Калужская область), Северо-Кавказского (Ставропольский край) и Сибирского (Республика Тыва) федеральных округов. Для исследования нуклеотидных последовательностей гена аrр использована технология капиллярного секвенирования. Предложена двухраундовая амплификация гена аrр, обеспечивающая корректное прочтение его внутреннего участка. В составе данных участков описаны 4 варианта 60-нуклеотидных повторов, отличающихся по составу 6, 8 и 15 — 17 триплетов. Охарактеризованы различные комбинации подобных повторов, соответствующие референсному штамму Nichols, глобально распространенной геногруппе Street 14, а также и впервые обнаруженному региональному варианту Stavropol. Продемонстрирована целесообразность секвенирования гена аrр как инструмента повышения эффективности молекулярного типирования Т. рallidum. Молекулярная эпидемиология, возникшая как результат интеграции молекулярно-генетических методов в традиционные эпидемиологические исследования, с конца XX века стала одним из основных инструментов контроля над распространением и изменчивостью возбудителей инфекционных заболеваний. В наибольшей степени этот подход оказался востребованным при анализе эпидемиологии некультивируемых патогенов, ярким примером которых является возбудитель сифилиса — Тгеропеша раШйит $иЪ$р. раШскш. Отправной точкой для разработки метода генотипирования бледной трепонемы стала расшифровка ее полного генома и последующее сравнение с геномами других представителей вида Т. раШйшп, позволившее идентифицировать на бактериальной хромосоме наиболее вариабельные локусы. На основании двух из них — генов агр и 1рг11 — в 1998 году был предложен первый метод молекулярного типирования Т. раШёшп 8иЪ$р. раШёит, в дальнейшем поддержанный СЭС (США) и получивший широкое распространение при анализе эпидемиологии сифилиса во всем мире как СЭС-метод. Использование для этих целей гена агр (ас1сПс гереа! рго1ет) определялось особенностями его структуры: наличием консервативных терминальных участков (в том числе мембрана-связывающего домена и сайта для сигнальной пептидазы I), а также находящегося между ними вариабельного фрагмента из 60-нуклеотидных тандемных повторов, занимающего 51% от общей длины гена. При этом предложенный подход к выявлению подобного полиморфизма основан на амплификации соответствующего участка гена аrр и последующего определения количества 60-нуклеотидных повторов на основе характеристик электрофоретической подвижности ампликона в агарозном геле. В зависимости от числа подобных повторов (от 2 до 22) идентифицируемому изоляту присваивается соответствующий цифровой индекс, в дальнейшем дополняемый буквенным обозначением, соответствующим определенному профилю полиморфизма длин фрагментов рестрикции продуктов амплификации генов 1рг11 (16 вариантов). Многолетний опыт использования СЮС-метода заставил констатировать ряд ограничений его дискриминирующей способности, в том числе связанных с выраженным доминированием вариантов Т. раШйиш зиЬзр. раШйиш с четырнадцатью повторами в гене агр. В этой связи, для повышения разрешающей способности метода было предложено дополнительное секвениро-вание генов 1р0136, 1р0319, 1р0548 и 238 рРНК, а также вариабельного участка гена 1р0548 (позиции 131 — 215). При этом последний подход, позволивший разделить подтип 14а на 2, а 14с1 на 4 отдельные подгруппы, получил наибольшее распространение и в настоящее время интегрирован в систему молекулярного типирования при сифилисе. Вместе с тем, анализ гена агр (слияние 1р0433 — 0434) свидетельствует о неполном раскрытии его дифференцирующего потенциала. Основанием для этого утверждения являются данные о неидентичном характере нуклеотидных последовательностей тандемных повторов, на основании которых могут быть выделены их I, II, III и П/Ш подтипы. Другой особенностью можетявляться различный порядок расположения этих подтипов в составе внутреннего фрагмента гена агр. Соответственно секвенирование гена агр вместо рутинной детекции ПЦР-продуктов его амплификации представляется перспективным направлением совершенствования СОС-метода, приводящим молекулярное типирование Т. раШс!ит шЬзр. ра1Нс1ит к стандартам мультилокусного секвенирования бактериальных геномов. В этой связи, целью настоящего исследования явился анализ вариабельности нуклеотидных последовательностей внутреннего фрагмента гена агр у современных российских штаммов Т. раШйит зиЬвр. раШс1ит, выполненный с использованием технологии капиллярного секвенирования (по Сенгеру). В исследование включены 57 клинических изолятов, полученных в 2016 — 2017 гг. из специализированных медицинских учреждений дерматовенерологического профиля Центрального (Калужская область), Северо-Кавказского (Ставропольский край) и Сибирского (Республика Тыва) федеральных округов. В качестве референса использован Т. раШйит $иЪ$р. ра1Пс1ит штамм №сЬо18, культивируемый на тестикулярной модели у кроликов. Выделение ДНК из исследуемого биоматериала проводилось с использованием набора реагентов «Проба-НК» (ДНК-технология, Россия). Присутствие генетического материала Т.раНЫшп зиЬзр. раНМит в полученных образцах подтверждалось методом ПЦР с праймерами к гену ро1А (регион 1156 — 1531 пар оснований), кодирующему специфическую ДНК-полимеразу I данного микроорганизма. Рутинное типирование подтвержденных клинических изолятов проводили с использованием СБС-метода путем амплификации гена агр, а также амплификации генов подсемейства 1рг11 с последующей рестрикцией эндонуклеазой Тги9 I (НПО СибЭнзим, Россия) и оценкой электрофоретиче-ской подвижности полученных продуктов в агарозном геле относительно маркеров молекулярных масс СепеКи1ег 100 Ьр Р1из ^NА ЬасШег (ТНегтоРь вЬегБаепШгс, США). В соответствии с рекомендацией Магга С.М. е! а1. дополнительно проводили секвенирование вариабельного участка гана 1р0548. Подбор праймеров для секвенирования вариабельного фрагмента гена агр осуществляли с использованием банка аннотированных нуклеотидных последовательностей Национального центра биотехнологической информации США (ОепВапк N081 115А) [11Цр://утлу.псЫ.п1т.шН.§оу/§епЪапк/] и оп-Нпе сервиса пис1еоПс!е ВЬАЗТ [Ьпр://\у\\^.псЫ.п1т.тЬ.§оу/]. Амплификация гена агр проводилась с использованием термоциклера БИА Еп§те йуас1 РеШег ТНегта1 Сус1ег (Вю-Каё, США). Очистка ПЦР-продукта после первого этапа амплификации проведена с использованием набора «СНАяшск РСК РипПсаНоп Кк» (01а§еп, Германия). Очищенный ПЦР-продукт был использован для второго этапа амплификации с применением меченых терминирующих нуклеотидов из набора реагентов В1§ Эуе Тептппа1ог у3.1 Сус1е 5ериепап§ Кк (АррНей Вю8у81ет8, США). Осажденные продукты ПЦР использовали для проведения секвенирования вариабельного фрагмента гена агр на приборе 3130 ОепеНс Апа1угег (АррПес! Вю8у81ет8, США) с применением программного обеспечения 3130 Оа1а СоПесНоп у.3.0. Первичная расшифровка нуклеотидных последовательностей вариабельного фрагмента гена агр проведена в программе 8еяиепст§ Апа1у818 5.3.1. Для выравнивания гена агр на референсные сиквенсы Т.раШйит зиЬзр. раШёит использована программа Ме§а 5. РЕЗУЛЬТАТЫ Исследование 57 образцов генетического материала Т.раШёит в соответствии с рутинной процедурой СОС относило их исключительно к 14 молекулярному субтипу по гену агр. Наличие гена агр с четырнадцатью 60-нуклеотидными тандемными повторами продемонстрировано и в референсном геноме Т. раПШшп штамм N1011018. Последующее типнрование по генам 1рг11 и 1р0548 позволило частично разделить анализируемую выборку, выделив в ней доминантный (14 <ЗД — 89,5%) и минорные (14 Ь/§ и 14 сД по 3,5%; 14 Ь/Г и 14 1/Гпо 1,7%) молекулярные субтипы. Однако однотипный характер гена агр существенно снизил эффективность дискриминации данных клинических изолятов. Тем самым полученный результат подтвердил декларированную необходимость совершенствования СОС-метода, в частности, путем углубленного анализа гена агр с применением технологии капиллярного секвениро-вания. Практическое решение этой задачи потребовало внесения изменений в протокол амплификации гена агр, поскольку использование предложенных РШау А. е{ а1. прямого и обратного праймеров как на этапе фрагментации анализируемого участка ДНК, так и в реакции амплификации с применением меченых терминирующих нуклеотидов, не обеспечивало качественного прочтения концевых участков анализируемых нуклеотидных последовательностей. В этой связи, нами была предложена процедура двухраундовой амплификации гена агр с использованием двух пар прямого и обратного праймеров. При этом использование первой (внешней) пары праймеров ориентировано на получение первичного ампликона размером 1643 п.о., расположенного между 388 и 1541 нуклеотидами в гене агр и наряду с его центральным участком из 60-нуклеотидных тандемных повторов дополнительно включающего фрагменты 5'- и З'-концевых консервативных участков. В свою очередь, на этапе секвенирования с использованием терминирующих нуклеотидов использовалась вторая (внутренняя) пара праймеров, амплифицирующая внутренний участок гена агр, полученного после первого раунда амплификации. Подобный подход обеспечил качественное прочтение участка гена агр между 414 и 1409 нуклеотидами (размером 1015 п.о.), результатом которого являлось как четкое определение количества 60-нуклеотидных повторов, так и их первичных нуклеотидных последовательностей. Результаты проведенного секвенирования во всех случаях подтвердили присутствие во внутреннем участке гена агр четырнадцати тандемных повторов, одновременно зафиксировав вариации их нуклеотидного состава, а также различный характер взаимного расположения подобных неидентичных повторов. Анализируемые повторы характеризовались высоким содержанием ОС-пар (67%), наличием двух палиндромных последовательностей (ССООСС и ОАООООАО), а также вариабельностью пяти триплетов в позициях 6, 8, 15, 16 и 17. Наиболее частэШ вариантом являлся 60-нуклеотидный повтор с триплетом СТО в 6 и ААС в 8 позициях, а также триплетами САС, СОТ и ОАО в 15 — 17 позициях. Ранее исключительное присутствие аналогичных 60-нуклеотидных повторов было показано у Т. раШйит, выделенных от обезьян, Т. ра1-Пс1ит $иЪ$р. реПепие и Т. раИйит зиЬкр. епёеть сит, что позволяет предполагать их эволюционную первичность, составившую основу д тя последующей дивергенции гена агр. Вторым по частоте встречаемости являлся повтор, отличающийся от описанного выше варианта единственным одно-нуклеотидным пол л-морфизмом — заменой пиримидинового основания во втором положении 6 триплета, приводящим к изменению кодируемой аминокислоты с аланина на ва-лин (С СО —> СТО; А -» V). Более существенными оказывались отличия третьего и четвертого вариантов, нуклео-тидные замены в 15 — 17 триплетах которых произошли по типу транзиции, т.е. путем замещения пуринового основание на пури-новое, а пиримидино-вое на пиримидиновое. При этом замены пу-риновых оснований во втором положении 15 (ОАО ООО) и 16 (СОТ САТ) триплетов повлекли за собой изменение кодируемых аминокислот с глутами-новой кислоты на глицин (Е —> С) и с аргинина на гистидин (К. —» Н), а ну-клеотидная замена в третьем положении 17 триплета (ОАО —» САА), напротив, не сопровождалась изменением кодируемой аминокислотной последовательности. Наконец, различия между третьим и четвертым вариантами 60-нуклеотидного повтора заключались в замене двух пуриновых оснований 8 триплета с соответствующим изменением кодируемой аминокислоты с лизина на глицин (ААО —» С ОС; К —» С). В целом полученные данные достаточно хорошо согласуются с известными представлениями о вариантах нуклеотидных последовательностей тандемных повторов гена агр, в то время как предложенная нами нумерация наиболее корректно отражает вероятные последовательные изменения их первичной структуры. Последующий анализ комбинаций расположения различных вариантов 60-нуклеотидных тандемных повторов во внутреннем участке гена агр приводил к заключению существованию нескольких молекулярных субтипов данного гена (рис. 2). Комбинация внутреннего участка гена агр у ргференсного штамма 1М1СН018 при прочтении от 5'-конца заключалось в нерегулярном чередовании повторов I и II типов, завершающихся двумя повторами IVтипа на З'-конце фрагмента. Однако формула подобной комбинации 5'-П-11-1-11-1-1-11-П-1I-1-ЫУ-1У-3' не была зафиксирована ни у одного из современных российских клинических изолятов Т. раШс1ит. На этом фоне наиболее распространенной в анализируемой выборке оказывалась комбинация 5'-ПII-1-11-1-1-Н-11-1У-1-1-1-1П-1У-3', установленная у 54 из 57 исследованных клинических изолятов и по своей последовательности соответствующая внутреннему фрагменту гена агр штамма 51гее1: 14. Тем самым соотнесение полученных данных с представлениями о существовании в глобальной популяции Т.раШйшп зиЬкр. раШйигп двух обособленных генетических кластеров, известными представителями которых являются штаммы М1сЬо1& (ЭаПаз, СЫса§о В и др.) и 51гее1 14 (РЫ1аёе]рЬ1а-1, А2 11 и др.), приводилок заключению о принадлежности российских изолятов к последней, также как это было показано для возбудителей сифилиса, циркулирующих в странах Восточной Европы. На этом фоне у трех клинических изолятов, поступивших из Северо-Кавказского федерального округа (Ставропольский край), была обнаружена ранее неизвестная комбинация внутреннего участка гена агр, состоящая только из повторов I и II типов, описываемая формулой 5'-П-11-1-11-1-1-П-11-1-11-П-1-1-1-3' и обозначенная нами как молекулярный вариант $*аугоро1. Тем самым подобная находка развивает предположение о существовании в глобальной популяции Т. раШёит киЬхр. раШйит более значительного разнообразия гена агр, что ранее было показано на примере одного из регионально распространенных вариантов — выделенного в Индии штамма Масказ. Молекулярное типирование Т. раШёит 8иЪкр. раИШит, основанное на исследовании вариабельных генов агр, 1рг11 и гр0548, в настоящее время стало распространенным и востребованным инструментом слежения за глобальной и региональной эпидемиологией сифилиса. В то же время, длительный опыт использования данного метода заставил констатировать ряд ограничений его дискриминирующей способности, в том числе определяемых высокой частотой встречаемости гена агр с четырнадцатью 60-нуклеотидными тандем-ными повторами. Предложенным в настоящем исследовании подходом к повышению эффективности генотипирования Т. раШдит явился переход от электрофорети-ческой детекции ампликонов гена агр к секвенированию его внутреннего вариабельного участка, реализованный с использованием оригинальной двух-раундовой процедуры амплификации. Проведенное секвенирование гена агр позволило получить три согласующихся результата: 1) отнести все исследуемые гены к вариантам с 14 нуклеотидными повторами; 2) подтвердить существование 4 вариантов 60-нуклеотидных повторов, отличающихся по составу 6, 8 и 15 — 17 триплетов; 3) описать различные комбинации подобных неидентичных повторов. При этом принципиально важным результатом стало выявление в российской популяции нескольких вариантов гена агр. Подавляющее большинство из них (54 из 57) относились к варианту, характерному для геногруппы §{гее1 14, что впервые показывает её доминирование в обследованных субъектах Российской Федерации. С другой стороны, вариант последовательного расположения 60-нуклеотидных повторов, характерный для геногруппы N1011018, был зафиксирован только у соответствующего референсного штамма, что свидетельствует о произошедшем полном вытеснении данного генотипа. Наконец еще одной принципиально важной находкой стало обнаружение ранее неизвестного варианта гена агр, имеющего четко ограниченный ареал распространения. Таким образом, результаты проведенного исследования принципиально подтвердили целесообразность секвенирования гена агр для повышения эффективности молекулярного типирования Т. раШёит, позволив дифференцировать вариант данного гена с четырнадцатью 60-нуклеотидными тандемны-ми повторами на несколько молекулярных субтипов. Планируемое увеличение количества исследуемых клинических изолятов с вовлечением субъектов Российской Федерации с традиционно высоким уровнем заболеваемости сифилисом потенциально должно еще более расширить дискриминирующую эффективность предложенного метода, позволив охарактеризовать пандемический и региональные молекулярные варианты Т. раНШшп $иЪ$р. раШёит. Одновременно продолжение исследований в обозначенном направлении явится шагом, приводящим молекулярное типирование возбудителя сифилиса к стандартам мультилокусного секвенирования бактериальных геномов.
Авторы:
Образцова О.А.
Издание:
Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 2018
Объем: 8с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.45-52. Библ. 13 назв.
Просмотров: 36