О ВАЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЭВОЛЮЦИОННО НАДЕЖНЫХ МАРКЕРОВ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ШТАММОВ МYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS ГЕНЕТИЧЕСКОГО СЕМЕЙСТВА LАМ

Аннотация:

Клиническая и эпидемиологическая значимость генетического семейства LАМ Мyсоbacterium tuberculosis определяет важность корректной детекции штаммов LАМ. В настоящем исследовании комплекс молекулярных методов был использован для анализа штаммов ЬАМ в популяции М. tuberculosis в Омской области Западной Сибири, для которой характерен высокий уровень заболеваемости резистентным туберкулезом. Изученная коллекция включала 207 штаммов М. tuberculosis, выделенных в Омской области в 2015 — 2016 гг. Методы исследования включали сполиготипирование, анализ полиморфизма Rv0129с 309G>А, специфического для семейства LАМ, полногеномное секвенирование с последующим биоинформационным анализом. В результате сравнения полученных профилей СК15РК-сполиготипирования с международной базой данных SITVIT_WEB 11 штаммов (5,3%) было отнесено к генотипу LАМ. В то же время, в результате анализа филогенетического SNР в гене Rv0129с к генотипу LАМ было отнесено 30 изолятов (14,5%). Для четырех изолятов, представляющих разные типы сполигопрофилей, было проведено полногеномное секвенирование. Полученные результаты показывают ограниченность правил принятия решения, имплементированных в SITVIT_WEB для определения семейства ЬАМ для штаммов с протяженными блоками делетированных спейсеров в локусе СRISPR или усеченными профилями сполготипирования. Для детекции штаммов LАМ может быть рекомендован подход, включающий (1) первичное сполиготипирование, сравнение с SITVIT_WEB и обязательное уточнение интерпретации профилей в свете экспертного знания; (2) детекцию LАМ-специфического (например, с помощью РСR-RFLP). Характерной особенностью вида МусоЬас1епит ШЬегси1о818 является строго клональная структура популяции как следствие отсутствия горизонтального генетического переноса. Помимо общебиологического смысла такого хода эволюции (обсуждение которого выходит за рамки данного сообщения), этот факт имеет и приклашое, клиническое значение применительно к реализации региональных программ борьбы с туберкулезом. В настоящее время общепризнано, что отдельные генотипы (генетические семейства, сублинии, клональные кластеры) М. шЬегси1о815 отмечены повышенной вирулентностью, трансмиссивностью, или способностью быстрого развития устойчивости к противотуберкулезным препаратам. Структуру популяции возбудителя туберкулеза в России и других странах постсоветского пространства часто воспринимают через призму доминирования резистентных штаммов генетического семейства Веут§. В делом обоснованный, такой подход упрощает реальность как в количественном, так и в качественном аспектах. В том, что касается собственно структуры популяции, штаммы генетического семейства ЬАМ (Ьайп Атепсап Мес1кеггапеап) также являются значимым компонентом популяции М. шЪегси1о51$, особенно в Европейской части бывшего СССР, и составляют до 30 — 40% локальных популяций, например, в центральной России и Белоруссии. Более того, рассматривая патобиологические особенности штаммов, нужно учитывать, что эмерджентные, потенциально или актуально эпидемические геноварианты отмечень не только среди представителей семейства Вещп§, но также и ЬАМ и еще одного (недостаточно оцененного) генотипа и!га1. В свою очередь, это подчеркивает необходимость применения четких, эволюционно надежных молекулярных маркеров для корректного определения таких генетических групп, имеющих клиническук и/или эпидемиологическую значимость. Эволюционно значимые геногруппы могут быть выявлены: (1) на основе детекции валидированных специфических ^Р (зш§1е пис1ео1гс1е ро1утогрЫ8т) или геномных делеций, представляющих уникальные и однонаправленные эволюционные события; (2) посредством филогенетического анализа (кластеризации) на основе множества независимых и нейтральных эволюционных маркеров, к которым могут быть отнесены полногеномные или локусы У1ЧТИ (уапаЫе пигпЬег оГ 1апс1еш гереа1;8). Генетическое семейство ЬАМ М. ШЪегси1о$15 впервые было описано в 2001 году в результате филогенетического анализа относительно глобальной коллекции сполигопрофилей [14]. Прототипным сполготипом ЬАМ является 81Т42, в профиле которого отсутствуют сигналы 21-24 и 33-36. Последующее применение эволюционно надежных маркеров подтвердило реальность ЬАМ и позволило более адекватно определить его филогенетические границы. Также можно отметить, что ЬАМ входит в крупную Евро-Американскую линию, хотя и определенную на основании БНР-анализа, но также имеющую характерный маркер на основании сполиготипирования, а именно отсутствие сигналов 33-36. В наших предыдущих работах на коллекциях штаммов из различных регионов бывшего СССР (Северо-Запад РФ, Белоруссия, Казахстан) и Китая были валидированы ранее описанные специфические 8ЫР в генах К.у0129с и К.у3062 для детекции штаммов ЬАМ [8 — 11]. В настоящем исследовании мы применили комплекс молекулярных маркеров для анализа штаммов ЬАМ в популяции М. 1иЬегси1о818 в Омской области Западнот Сибири, для которой характерен высокий уровень заболеваемости резистентным туберкулезом, и расширили их верификацию с использованием полногеномного секве-нирования следующего поколения: ^08 (\уЬо1е §епоте $ециепс1п§)/М05 (пех! §епега1юп §едиепст§). Штаммы М. ШЬегси1о§15 были выделены от больных туберкулезом легких, постоянно проживающих в Омской области. ДНК выделяли стандартным методом с использованием 505, протеиназы К и цетилтриметиламмонийбро-мида для клеточного лизиса. Сполиготипирование проводили согласно стандартному протоколу с использованием мембраны с иммобилизованными олигонуклеотидами на 43 спейсера локуса СК.15РК М. шЪегси1оз15, изготовленной в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ им. Пастера. Профили сполиготипирования сравнивали с международной базой данных 81ТУ1Т_\УЕВ ра81еиг-Еиаае1оире.Гг:8081/81ТУ1Т_01ЧПШ/). Анализ однонуклеотидного полиморфизма в гене Ку0129с 3090А, специфического для семейства ЬАМ, проводили методом ПЦР-ПДРФ. Полногеномное секвенирование проводили с использованием платформы М18ея (Шитта), используя реагенты для получения парных прочтений длиной по 300 нуклеотидов. Для подготовки ДНК-библиотек для секвени-рования использоваш ультразвуковую фрагментацию ДНК и применяли набор Ыкга Э1ЧА ЫЪгагу Ргер Кк Гог Шитша Еп§1апс1 Вю1аЪ8). Первичную обработку коротких нуклеотидных прочтений (Га§1ц файлов) проводили с использованием программы Тпттота1ю (ЬЦр://\у\у\у.и8ас1е11аЪ. огё/ст5/1п(1ех.рЬр?ра§е=1;пттота1:1с) для удаления адаптеров и нуклеотидных прочтений низкого качества. Полученные файлы использовали для выравнивания на референсный геном М. ШЪегси1о818 Н37Ку (1МС_000962.3) для дальнейшего поиска геномных вариантов. Нуклеотидные прочтения выравнивали на референсный геном с использованием инструмента Ъо\у1ле2, после чего для идентификации и аннотации нуклеотидных полиморфизмов использовали утилиты 5АМ{оо1$ (Н11р://8ат1:оо1$.8оигсеГог8е.пе1:). Онлайн-ресурсы РНугеззе (Ьир8://ЪютЬГ2-Ъог81е1.с1е/гпс111р8/рНуге88е/), ТС8-ТВ (|1ир8://ёрЬ.П11ё.§о..|рД§8-1;Ь/) и РЬуТВ (Ьир://ра11ю§еп8ер.18Ы;т.ас.ик/ рЬуЛПуе/тйех.рНр) использовали для дополнительной классификации сек-венированных геномов. Дополнительно штаммы ЬАМ были типированы на наличие специфической инсерции 186110 в определенной позиции в гене р1сА (позиция 2630571 в геноме штамма Н37К.У, номер доступа 00962.3 вОепВапк), которая является маркером подгруппь внутри ЬАМ, ранее названной ЬАМ-КЬ$. Изученная коллекция включала 207 штаммов М. 1иЬегси1о818, выделенных в Омской области в 2015-2016 гг. В результате сравнения полученных профилей сполиготипирования с базой данных 51ТУ1Т_\УЕВ 11 штаммов (5,3%) было отнесено к генотипу ЬАМ. В то же время, в результате анализа филогенетического 5НР в гене Ку0129с к генотипу ЬАМ было отнесено 30 изолятов (14,5%) (табл.). Дополнительно все 30 изолятов ЬАМ были определены как ЬАМ-КЬЗ. Для четырех изолятов, представляющих разные типы профилей внутри изученной выборки ЬАМ, проведено полногеномное секвенирование с использованием технологии следующего поколения. Таким образом были изучены: штамм 51Т42 (классический прототипный профиль для семейства ЬАМ), штамм 81Т254 с протяженным блоком делетированных спейсеров, штаммы 51Т1451 и §1Т_пе\у с усеченными профилями гибридизации при сполиготипировании. Сравнение с базой сполиготипов 51ТУ1Т_\УЕВ корректно отнесло первый из штаммов (81Т42) к ЬАМ . в то время как штамм 81Т254был отнесен к семейству Т5- РШ51, а для двух последних штаммов их филогенетический статус в §1Т\1Т_\УЕВ определен не был. Для указанных 4 штаммов проведено полногеномное секвенирование и полученные файлы ГазЦ были загружены в нуклеотидный архив 1МСВ1, проект РК.1ЫА401339. В результате выравнивания на референсный геном М. 1иЬегси1о818 Н37К.У для каждого штамма получен перечень геномных вариантов, включающий однонуклеотидные полиморфмзмы и короткие инсерции и де-леции (усГфайлы). Файлы Га§1:ц и усГ были проанализированы с использованием онлайн-ресурсов РЬугеззе, РЬуТВ и ТС8-ТВ, с помощью которых была подтверждена принадлежность всех 4 штаммов к ЬАМ. Кроме того, следует отметить в изученной омской выборке штамм с профилем 51Т264 с протяженным блоком из 12 делетированных сигналов, отнесенный к семейству Т1 в базе 81ТУ1Т \УЕВ. Однако ранее нами была показана принадлежность штамма с таким сполигопрофилем, выделенного в Санкт-Петербурге, к генотипу ЬАМ на основании полногеномного анализа. Ряд предыдущих исследований штаммов М. ШЬегси1о518 генетического семейства ЬАМ показал его клиническую и/или эпидемиологическую значимость, ассоциацию с лекарственной устойчивостью, хотя данные по повышенной вирулентности этих штаммов противоречивы. Тем не менее, в целом это определяет важность корректной детекции штаммов ЬАМ на основе эволюционно надежных генетических маркеров (к которым сполиготипирование отнесено быть не может). Полученные нами результаты показывают серьезную ограниченность правил принятия решения (с1ес18юп ги1ез), имплементирован-ных в 81ТУ1Т_\УЕВ и описанных в работе Оетау С. е* а1 для определения семейства ЬАМ. В результате применения алгоритма 51ТУ1Т_\УЕВ значительная часть штаммов ЬАМ в странах бывшего СССР или относ этся к семейству Т, или вообще остается неопределенной (из-за крайней усеченности сполигопрофиля (штамм с профилем 51Т1451. В настоящем исследовании только 5,3% штаммов в Омской коллекции М. ШЪегси1о$15 было отнесено к ЬАМ в результате сполиготипирования, в то время как в результате применения 8НР/\У08 маркеров эта цифра выросла почти в 3 раза (до 14,5%). Технология секвенирования следующего поколения становится все более доступной для полногеномного секвенирования патогенных бактерий, и М. ШЬегси1о818 не является исключением. Подход на основе ХУ08/1Ч08 позволяет выявить незначительные различия близкородственных геновариантов и успешно применяется как для филогеномных, так и для молекулярно-эпидемиологических исследований. Противоположным с точки зрения дискриминирующей способности является классический метод сполиготипирования. Практически единственным достоинством метода является его техническая простота и, следовательно, возможность быстрого анализа больших коллекций, а также наличие больших баз данных, собранных в результате 20 лет исследований. Прежде всего следует отметить глобальную базу данных 51ТУ1Т_\УЕВ, созданную в Институте Пастера Гваделупы. Последняя (все еще неопубликованная) версия этой базы (81ТУ1Т2) содержит данные по более чем 110 ООО изолятам, согласно диссертации О. Сотап. Известными и серьезными ограничениями метода сполиготипирования являются как универсальные для всех бактерий (единый локус СК18РК, следовательно, не независимая эволюция спейсеров и т.о. неадекватность филогенетических построений на основе сполиготипов), так и специфические для М. ШЪегси1о818 (возможная гомоплазия как результат конвергентной эволюции, неопределенность интерпретации протяженных блоков делетированных сигналов). Глобальной проблемой анализа сполигопрофилей является и догматическое, некритическое восприятие крупных электронных ресурсов и баз данных. Определение семейства ЬАМ М. ШЬегси1о818 на основании сполиготипирования (в особенности профилей с протяженными блоками делетированных сигналов, например, 81Т254, 81Т264, 81Т1451) имеет два существенных недостатка, как показано в настоящем и ряде предыдущих исследований в странах бывшего СССР. Во-первых, наличие усеченных профилей сполиготипирования (81Т1451) или профилей с длинными блоками делетированных сигналов (81Т264, 81Т254) критически уменьшает количество признаков, пригодных для анализа, и не позволяет делать вывод о генотипе (семействе) штамма даже если алгоритм, применяемый в 81ТУ1Т_\УЕВ, и позволяет (хотя и ошибочно) отнести такой штамм например 81Т254 или 81Т264, к какой-либо подгруппе внутри семейства Т (прежде всего к т.н. Т5-К1181, куда отнесены эти и близкие им производные сполиготипы в 81ТУ1Т_\УЕВ). Во-вторых, сполиготип 81Т803 представляет пример гомоплазии сполиготипов как результат конвергентной эволюции локуса СКЛ8РК. М. ШЪегси1о$18. В частности, как показано в данном исследовании (на основании полногеномного анализа) и в опубликованных работах по Северо-Западу России, Казахстану и Грузии (на основании анализа 1АМ-специфических 8NР и мультилокусного УМТК-анализа), штаммы 81Т803 определенно относятся к семейству ЬАМ. В то же время, анализ китайских штаммов с таким сполиготипом не выявил у них ЬАМ-специфического 8М. На построенной нами дендрограмме профилей 24-М1ГШ-УМТК. 186 референс-штаммов М. ШЬегси1о818 разных генотипов (МИШ-УЫТКрШз.огё) и 259 типов глобальной коллекции ЬАМ китайские штаммы 81Т803 занимали положение далеко за пределами ветви ЬАМ и располагались на периферии ветви семейства 8 (древо не показано). Все это подчеркивает необходимость осторожности в интерпретации сполигопрофилей с небольшим количеством сигналов гибридизации. В то же время, даже в настоящее время все более широкого применения полногеномного анализа полезно сопоставлять новые данные со все еще применяемыми старыми маркерами и схемами. Не все лаборатории, особенно в странах с ограниченными ресурсами, могут использовать N08 в качестве рутинного подхода. Конкретно для детекции штаммов ЬАМ может быть рекомендован подход, включающий (1) первичное сполиготипирование, сравнение с 81ТУ1Т_\УЕВ и обязательное уточнение интерпретации профилей в свете экспертного знания; (2) детекцию ЬАМ-специфического 5ОТ (например, с помощью РСК-КРЬР).

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 2018
Объем: 7с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.60-66. Библ. 15 назв.
Просмотров: 28