НАУЧНО-МЕТОДИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОВЕРШЕНСТВОВАНИЯ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ КОЛЛЕКЦИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ ВОЛГОГРАДСКОГО НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОГО ПРОТИВОЧУМНОГО ИНСТИТУТА

Аннотация:

В обзоре отражено современное состояние коллекционной деятельности и представлены направления ее совершенствования в рамках проведенной паспортизации коллекции патогенных Burholderia sрр. Волгоградского научно-исследовательского противочумного института. Рассмотрены пути модернизации существующих методов консервации, оптимизации современных методов фенотипической и молекулярно-генетической характеристики штаммов патогенных микроорганизмов, а также предложена информационная система каталогизации с формированием универсальной базы данных. Коллекции патогенных микроорганизмов играют важную роль в целом ряде мероприятий, направленных на обеспечение санитарно-эпидемиологического благополучия населения. Изучение свойств возбудителей инфекционных заболеваний необходимо при мониторинге территорий в случае природно-очаговых инфекций и расследовании путей завоза и распространения на неэндемичных для них регионах. К направлениям совершенствования деятельности учрежденческих коллекций патогенных микроорганизмов относятся: оптимизация существующих методов и разработка новых технологий консервации, использование современных методов фенотипической и молекулярно-генетической паспортизации, внедрение новых информационных технологий каталогизации, паспортизации и учета движения патогенных штаммов, а также формирование универсальной единой базы данных. Возбудители мелиоидоза (ВигкЬоШепа ркеи^ошаНе!) и сапа (ВигкЬоШепа гпаНе!) относятся к микроорганизмам II группы патогенности (опасности) и являются потенциальными агентами биотерроризма группы В. Роль В. р$еиёота11е1 и В. та11е1 в инфекционной заболеваемости человека и некоторых животных рассматривается, главным образом, в связи с существованием эндемичных регионов и появлением завозных случаев инфекций. Сап — зоонозная антропургическая инфекция, регистрируемая в Монголии, Турции, Иране, Ираке, странах Аравийского полуострова, Китае, Индии, Индонезии, Филиппинах. Случаи заражения человека связаны с профессиональной деятельностью: ветеринары, работники мясоперерабатывающих предприятий, сотрудники лабораторий, дрессировщики лошадей. В. р$еи<}ота11е1 входит в состав микробиоты почвы и воды стоячих водоемов. К странам, где распространен возбудитель мелиоидоза, относятся Индия, Шри-Ланка, Филиппины, Индонезия, Таиланд, Сингапур, Вьетнам, Малайзия, Бирма, Бразилия, Пуэрто-Рико, страны Тихоокеанского региона, Иран и Австралия. В исследовании ЗагоуюЬ 0.5. е1 а1., показано распространение В.р8еис1ота11е1 в мире с указанием эндемичности мелиоидоза также и для Африки. В США, странах Европы встречаются спорадические случаи этого заболевания у людей, прибывших с эндемичных территорий. Так, в 2016 г. был зарегистрирован случай заражения мелиоидозом во Франции у туриста, прибывшего из Вьетнама. Потенциальная возможность завоза мелиоидоза и сапа на территорию Российской Федерации, а также опасность преднамеренного использования В.р5еис1ота11е1 и В.та11е1 в качестве средства биологического терроризма диктует необходимость наличия представительной коллекции охарактеризованных штаммов этих микроорганизмов как базы для проведения исследований (изучения свойств возбудителей, разработки и испытания средств диагностики, внедрения современных методов и новых технологий и др.). Коллекция микроорганизмов Волгоградского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора входит в перечень биологических и генетических коллекций РФ (Нир://\у^л-.зеУ1П.ги/со11есиоп5/гп1сгоог§а1й5т8.Ь1;т1) и включает 14 штаммов В.та11е1, выделенных в различных географических регионах (Монголия, Югославия, Венгрия, Польша, Индия, Индонезия), и 59 штаммов В.рзеи(1ота11е1 (Вьетнам, Австралия, Таиланд), полученных в 1970 — 1980 гг. прошлого столетия из научно-исследовательских учреждений Советского Союза. Штаммы возбудителя мелиоидоза и сапа содержатся и в коллекциях микроорганизмов США, Великобритании, Бразилии, Венесуэлы, Таиланда и Малайзии, а также в государственных коллекциях патогенных бактерий РФ (Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», ГКПМ, Оболенск). Основная роль в изучении данных видов микроорганизмов в РФ отводится Волгоградскому научно-исследовательскому противочумному институту Роспотребнад юра, на базе которого функционирует «Референс-центр по мониторингу за возбудителями сапа и мелиоидоза» — координирующий, консультативно-методический, учебный, диагностический и экспертный орган по вопросам индикации, экспресс-диагностики, идентификации и типирования В.р§еис1ота11е1 и В.та11е1 на территории Российской Федерации. Технологии консервации. Первостепенной задачей коллекции микроорганизмов является сохранение штаммов в неизменном состоянии в течение длительного периода времени. Это осуществляется чаще всего с помощью методов сублимационного высушивания или криоконсервации при низких температурах (-20—85°С), каждый из которых имеет преимущества и недостатки. Лиофилизация (сублимационное высушивание, замораживание-высушивание) — широко распространенный способ высушивания биоматериалов из замороженного состояния, при котором вода испаряется в условиях вакуума без оттаивания льда, что позволяет полностью сохранять первичную структуру объекта. В зависимости от способа размещения биопрепаратов при высушивании различают сублимационные установки коллекторного и камерного типа. Процесс лиофилизации представляет собой стрессовый фактор, вызывающий у микробных клеток ряд различных изменений. Отмечено, что после 24 лет хранения в ампулах в лиофилизированном состоянии штаммы возбудителя сапа при высеве на питательные среды оставались жизнеспособными. Однако с увеличением сублимационных циклов высушивания наблюдалось снижение окислительной активности штаммов В.таНе! по отношению к глюкозе, а также потеря протеолитической способности по отношению к желатине, зависящей от сроков хранения штамма. Аналогично, вакцинный штамм РгапскеНа Ш1агеп§18 15 НИИЭГпосле 60 лет хранения в лиофилизированном состоянии при высеве на питательные среды всё еще сохранял жизнеспособность, однако характеризовался снижением иммуногенных свойств и незначительными изменениями в геноме. Такой длительный срок хранения коллекционных штаммов с сохранением в целом основных свойств является преимуществом рассматриваемого метода. Однако используемая для этого установка К.Е.Долинова морально и физически устарела, но до сих пор является единственной, на которую имеется регламентирующий документ федерального уровня «Инструкция по лиофильному высушиванию возбудителей инфекционных заболеваний I — IV групп на коллекторном аппарате системы К.Е.Долинова». Современные аппараты для лиофильного высушивания предназначены для консервирования биологического и фармацевтического материала и не имеют регламентирующих документов, разрешающих их использование в работе с микроорганизмами I — IV группы патогенное™. Кроме того, современные установки не могут полностью обрабатываться дезинфектантами и не подлежат автоклавированию. В исследовании по оценке возможности применения различных сублимационных систем для лиофилизации патогенных микроорганизмов бактериальной природы было установлено, что препараты, полученные на трех лиофильных сушках коллекторного типа (аппарат системы К.Е.Долинова, Майт СЬпз! А1рЬа 1-4 ЬОр1и$ и НеШ Рошег Эгу), сохраняют максимальное количество жизнеспособных клеток в прдцессе хранения. Показатели выживаемости у штаммов, высушенных на этих аппаратах, находились в интервале от 97,3 до 98,7%. При этом биопрепараты, полученные с помощью современной установки Не1о Ро\уег Огу, обладали максимальным прогнозируемым сроком хранения до 105 лет. В работе Червяковой Н.С. и др. получены данные по лиофилизации во флаконах при помощи современной сушки камерного типа МаЛт СЬп$1 ЕрзПоп 2-60 штаммов III — IV группы патогенности. Авторы указывают на недостатки камерной системы из-за наличия жизнеспособных клеток микроорганизмов на рабочих поверхностях лиофильной камеры, что обусловливает высокий риск создания аварийной ситуации с ПБА. Для обеспечения биологической безопасности необходимо модернизировать данное инженерно-техническое оборудование с возможностью проводить дезенфекцию камеры в автоматическом режиме до момента ее разгерметизации. В то же время, показатели жизнеспособности клеток, лиофилизированных с помощью камерной сушки Майт СИга! ЕркПоп 2-60, зависели от вида микроорганизмов и были в целом ниже, чем у препаратов, лиофилизированных на системах коллекторного типа. В Волгоградском НИПЧИ для сублимационного высушивания микроорганизмов IV группы патогенности используется лиофильная сушка коллекторного типа нового поколения Соо18а1е 110 Ргееге Огуег. К преимуществам данной системы следует отнести короткий временной цикл лиофилизации (2,5 ч) и возможность обработки дезинфектантами ее составляющих частей; к недостаткам — ограниченное количество ампул, получаемых за один цикл работы (16) и риск возможной аварии с ПБА на этапе их запаивания в ручном режиме. Для использования этого метода консервации патогенных микроорганизмов необходима инженерно-техническая модернизация системы Соо15а1е 110 Ргеехе Огуег, обеспечивающая биологическую безопасность на всех этапах работы. Кроме того, также необходимо создание регламентирующих документов, разрешающих использование данной системы для работы с микроорганизмами I — IV группы патогенности с утверждением их на федеральном уровне. Известно, что лиофилизированные культуры и в ампулах, и во флаконах необходимо хранить в темноте при 1 — 4°С. При комнатной температуре и тем более при 30°С наблюдается быстрое отмирание клеток. Поэтому для данного способа хранения микроорганизмов необходимо наличие системы основного и резервного холодильного оборудования в лаборатории коллекции. Низкотемпературная консервация по сравнению с лиофилизацией для хранения микроорганизмов более универсальна в связи с наличием и доступностью оборудования — низкотемпературных холодильников. Однако данный способ предполагает наличие системы постоянного температурного контроля, аварийной сигнализации с уведомлением об изменении температурного состояния, системы охлаждения помещения хранилища, дублированное энергоснабжение, а также резервные морозильные камеры. Кроме того, время хранения биоматериала при этих температурах также ограничено. Длительность хранения бактерий при этом зависит от биологических особенностей штамма и от условий замораживания и хранения (скорость охлаждения-оттаивания, температура и среда культивирования). По данным ОШзоп Ь.Р. и КЬоигу 1.Т., в холодильнике при температуре -70°С время хранения разных видов бактерий колебалось в пределах 12 — 40 месяцев. По данным Эе РаоН Р. метод криокон-сервации при низких температурах позволял сохранять бактериальные клетки без пересевов до 10 лет. Результаты исследований по хранению штаммов патогенных микроорганизмов в государственной коллекции Роспотребнадзора показывают, что штаммы УШпо сЬо1егае, Ргапс1зе11а 1и1агеп$1$, ВгисеНа аЬойиз устойчивы к замораживанию и хранению при -70°С с использованием оптимальной среды и в присутствии криопротекторов. Для холерных вибрионов наиболее высокая выживаемость с сохранением основных диагностических признаков наблюдалась при применении лактозо-желатиновой среды, для штаммов возбудителя туляремии и бруцеллеза — сахарозо-желатиновой среды и бульона Альбими с 10% глицерином. При этом установлено некоторое снижение количества жизнеспособных клеток как на этапе замораживания, так и в процессе хранения. В целом, оба описанных метода сохранения референтных штаммов патогенных микроорганизмов необходимы для одновременного использования в коллекциях. Культуры в лиофилизированном состоянии в виде ампул/флаконов удобны для транспортировки при передаче из учреждения в учреждение, а также в качестве резервного многолетнего источника штаммов в замороженном состоянии — для оперативной повседневной деятельности (выдача в структурные подразделения, изучение свойств и т.д.). Современные методы фенотипической и молекулярно-генетической паспортизации. Важным направлением деятельности коллекций микроорганизмов является установление таксономической принадлежности штаммов и подтверждение их аутентичности в процессе воспроизводства. Систематика бактерий постоянно обновляется и совершенствуется, в связи с чем существует необходимость в периодическом проведении номенклатурной ревизии штаммов коллекций. Нередки случаи, когда штамм, идентифицированный по фенотипическим свойствам классическими методами как определенный вид, при более детальном изучении оказывался иной видовой принадлежности. Внедрение в лабораторную практику новых методов и технологий обусловливает применение их как для верификации видовой принадлежности коллекционных штаммов, так и для изучения их свойств. Поэтому в крупных международных коллекциях и государственных коллекциях патогенных микроорганизмов РФ для подтверждения аутентичности референтных штаммов сегодня используется ряд современных автоматических технологий, в частности биохимическое профилирование с применением микробиологических анализаторов, масс-спектрометрия по технологии МАЬ01-ТоР, рибопринтинг, фрагментарное, мультилокусное и полногеномное секвенирование.

Авторы:

Издание: Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии
Год издания: 2018
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.117-126. Библ. 36 назв.
Просмотров: 64