Морфологические и метаболические показатели эритроцитов при обработке озоном эритроцитной массы

Аннотация:

Изучение морфологии эритроцитов и сопряженности морфологических показателей с процессами липопероксидации содержанием органических фосфатов в эритроцитах при обработке эритроцитной массы разных сроков хранения озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 2 мг/л. Исследовали морфологию эритроцитов крови человека, концентрацию в них малонового диальдегида (МДА), активность каталазы, содержание АТФ и 2,3дифосфоглицерата (2.3ДФГ) до и после обработки эритроцитной массы сроком хранения 7, 14, 21 и 30 суток озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 2 мг/л. Действие озона (2 мг/л) in vitro на эритроцитную массу 7-21 суток хранения способствовало восстановлению формы эритроцитов, увеличивало в них синтез АТФ и 2,3ДФГ, оптимизировало процессы перекисного окисления липидов. При сроках хранения эритроцитной массы 30 суток озон не оказывал выраженного положительного влияния на изучаемые показатели. Обработка эритроцитной массы озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 2 мг/л вызывала восстановление содержания дискоцитов за счет оптимизации процессов липо-пероксидации в мембранах клеток и увеличивала синтез органических фосфатов вследствие активизации гликолиза и пентозофосфатиого шунта, что может быть использовано для улучшения морфологического и метаболического статуса эритроцитной массы перед ее трансфузией. Одномоментная потеря 30-50% объема циркулирующей крови (ОЦК) сама по себе обычно не является непосредственной угрозой для жизни, но предвещает начало тяжелых осложнений, с которыми организм самостоятельно справиться не может. Лишь потеря не более 25% ОЦК может быть компенсирована организмом самостоятельно за счет защитно-приспособительных механизмов. Наиболее действенным средством, если кровопотеря значительна, является проведение трансфузии эритроцитной массы и восстановление органного кровотока (перфузии) путем достижения необходимого ОЦК. Одним из факторов, компенсирующих последствия анемии, является также и увеличение коэффициента утилизации кислорода тканями. Однако известно, что при хранении эритроцитной массы происходит уменьшение концентрации АТФ и 2,ЗДФГ в эритроцитах, увеличение в них содержания калия и лактата. Через сутки хранения ухудшается кислородтранспортная функция эритроцитов. Ко 2-й неделе хранения эритроцитной массы отмечается снижение деформируемости эритроцитов. При этом сохраняющиеся эритроциты образуют микровезикулы, которые содержат фосфатидилсерин, что способствует облегчению генерации тромбина. Кроме того, консервированные эритроциты теряют осмотическую резистентность, что приводит к их разрушению и развитию «сладж-синдрома». который еще в большей степени усугубляет ишемию тканей. Поэтому актуальным является изучение методов направленных на улучшение свойств хранящейся крови. Указанные недостатки могут быть нивелированы применением препаратов восстанавливающих мембранные свойства эритроцитов и улучшающих метаболические процессы в них. Известно, что озонотерапия приводит к улучшению реологических свойств крови, повышению отдачи оксигемоглобина кислорода ткани и увеличению скорости микроциркуляции. Кроме того, взаимодействуя с двойными связями ненасыщенных жирных кислот эритроцитарной мембраны, озон повышает ее эластичность. В результате озонотерапии наблюдается снижение концентрации продуктов перекисного окисления липидов в крови с одновременной активацией ферментативного звена антиоксидантной защиты. Ранее мы выявили, что при обработке эритроцитной массы озонированным физиологическим раствором (концентрации озона 0,5-15 мг/л) наибольший эффект на увеличение содержания АТФ и 2,ЗДФГ в эритроцитах оказывает концентрация озона 2 мг/л. В свою очередь, энергетические процессы опосредуют функциональную активность клеток и модификацию их мембранных свойств. Между тем структурные показатели мембран эритроцитов, которые определяют биологическую полноценность консервированной крови, при действии озона на эритроцитную массу различных сроков хранения не исследовали. Цель работы - изучение морфологии эритроцитов и сопряженности морфологических показателей с процессами липопероксидации и содержанием органических фосфатов в эритроцитах при обработке эритроцитной массы разных сроков хранения озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 2 мг/л. Объектом исследования служила стабилизированная гемоконсервантом ЦФДА (Натрия цитрат + Лимонная кислота + Натрия дигидрофосфат + Декстроза + Аденин) в соотношении 1:4 эритроцитная масса крови человека. Донорскую кровь получали на станции переливания крови. Заготовку крови и получение из нее компонентов производили в соответствии с «Инструкцией по заготовке и консервированию крови», утвержденной МЗ РФ 29.05.99. Эритроцитная масса хранилась при <: 4°С 7,14,21 и 30 суток. В ходе исследования сформировали 2 серии: 1-я серия — эритроцитную массу (2 мл) смешивали с озонированным раствором натрия хлорида 0,9% в эквивалентном объеме, содержащим концентрацию озона 2 мг/л. 2-я серия (контроль) — эритроцитную массу (2 мл) смешивали с раствором натрия хлорида 0,9% в эквивалентном объеме. В каждой серии было проведено 12 проб. Озонирование физиологического раствора производили на установке озонаторной терапевтической автоматической УОТА-60-01-»Медозон» (Россия). Установка изготовлена в соответствии с ТУ 9444-001-11441871-97 и может быть использована в медицинских учреждениях. Озонирование физиологического раствора производили непосредственно перед смешиванием его с эритроцитной массой и через 60 мин исследовали морфологию эритроцитов, концентрацию в них малонового диальде-гада (МДА), активность каталазы, концентрацию АТФ и 2,ЗДФГ. Уровень физиологической нормы исследуемых показателей определяли в эритроцитной массе в день ее заготовления, проводя измерение показателей в 12-и пробах. Анализ морфологии эритроцитов проводили в мазках крови методом световой микроскопии. Концентрацию МДА определяли по реакции с тиобарбитуровой кислотой. Плотность окраски триметинового комплекса регистрировали при 530 нм. Для расчета концентрации МДА использовали коэффициент молярной экстинции Е=1,56* 10"5М 'см '. Активность каталазы анализировали по снижению пероксида в пробе. Измерения проводили спектрофотометрически сразу после внесения И202 в кювету и через 20 секунд после внесения при длине волны 240 нм. Активность каталазы (А) рассчитывали по формуле: А- (1§ Е,/Е2 х 120000)/ НЬ (мкмоль Н202 / минХмг НЬ), где Е,, Е2 - экстинцпя опытной пробы сразу и через 20 сек. после внес ения Н202; НЬ - количество гемоглобина. Содержание 2,3-ДФГ и АТФ в суспензии отмытых эритроцитов исследовали неэнзиматическим методом, определяя неорганический фосфор (Рн) в гадролизатах эритроцитов фотоэлектрокалориметрически. Отмытые эритроциты (1 мл) гемолизировали холодной дистиллированной водой (2 мл) в течение 20 мин, белки осаждали 12% ТХУ (2 объема), а осадок отделяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 15 мин. с последующим фильтрованием надосадочной жидкости через бумажный фильтр. ТХУ фильтрат гемолизирован-ных эритроцитов использовали для определения АТФ и 2,3-ДФГ. При определении АТФ к 1 мл ТХУ фильтрата добавили 1 мл 2Н НС1 и проводили гидролиз в кипящей водяной бане 7 мин. с последующим охлаждением I нейтрализацией равным объемом 2Н ЫаОН. Определял! неорганический фосфор (Рн), в состав которого входил Рн, отщепившийся от АТФ после гидролиза, и Рн до г адро-лиза. Для определения 2,3 ДФГ из ТХУ фильтрата гемолизированных эритроцитов удаляли нуклеотиды (АТФ, АДФ, АМФ) путем адсорбции на активированном угле с последующим центрифугированием. В супер-натайте (0,5 мл) определяли Рн1 (пробирка 1). Часть ТХУ фильтрата (0,5 мл) подвергали озолению, добавляя 0,5 мл 5% раствора нитрата магния, кипятили и после охлаждения содержимое пробирки растворяли в 0,5 мл 0,36Ы Н2504. В 0,5 мл супернатанта измеряли Рн2 (пробирка 2). Определяли Рн в каждой пробирке, регистрируя плотность окраски на фотометре фотоэлектрическом КФК-3 (А=660 нм). Концентрацию Рн определяли по калибровочной кривой, используя стандартный раствор КН2РО,|. Расчет концентрации 2ДДФГ проводили по формуле (Рн1х 100 - Рн2 х 10)/2. После доказательства принадлежности экс 1ери-ментальных данных к нормальному распределению с использованием критерия Шапиро-Уилка определяли значения средних арифметических и стандартных ошибок средних. Для сравнения двух подгрупп использовали ^-критерий Стьюдента. Результаты и обсуждение В ходе проведенного исследования была выявлена значимая способность озона влиять на соотношение патологических форм эритроцитов и дискоцитов консервированной эритроцитной массы в пользу последних на всех сроках хранения. Если на 7-е сутки в эритроцитсодержащей среде превалировали двояковогнутые дискоциты, то через 30 суток хранения в ней наблюдалось большее количество эхиноцитов и сфероцитов. Использование озона восстанавливало патологи'- ески измененные формы эритроцитов, наиболее е ыра-жено это проявлялось при обработке озонированным физиологическим раствором эритроцитной массы с 7-х по 21-е сутки ее хранения. Озонирование эритроцитной массы на этапе 7-суточного ее хранения вызывало рост содержания дискоцитов с 60,5±1,97% до 97,4±2,97% при значительном уменьшении количества эхиноцитов и сфероцитов относительно эритромассы без обработки озоном. На 14-е сутки хранения эритроцитной массы количество дискоцитов снижалось за счет увеличения пула эхиноцитов различных форм. Их относительный прирост и снижение доли дискоцитов составил в среднем 18,9% (р<0,05) и 13,4% (р<0,05) соответственно. Полученные данные сочетаются с результатами других авторов, которые отмечают к 9-12 суткам хранения специфическое изменение наноструктуры мембраны эритроцитов, образование структурных кластеров, которые являются пусковым механизмом формирования эхиноцитов. Озонирование эритромассы на данном этапе значительно изменяло картину пойкилоцитоза, практически восстанавливая эритроцитный пул к характеристикам 7 суточного срока хранения. 21-е сутки хранения эритроцитной массы -пограничный срок в возможности предтрансфу-зионной реабилитации консервированных эритроцитов озоном. На этом этапе отмечено значительное (с 36,6 до 59,1%) (р<0,05) увеличение количества эхиноцитов. Однако, после обработки озона эритроцитной массы этого срока хранения морфологический состав трансформировался до дискоцитов на 67,0%. К 30-м суткам хранения эритроцитной массы наряду с дальнейшим ростом эхиноцитарной трансформации, увеличивалось количества сфероцитов. Кроме того, наблюдалась агрегация эритроцитов. Исследования, посвященные реологии крови подчеркивают, что переливание эритроцитной массы поздних сроков хранения сопровождается большим количеством осложнений и худшим клиническим результатом, что объясняется неспособностью сфероцитов к транскапиллярному транспорту, а также микросгустковым, сладжевым блокированием капиллярного русла. Использование озона было малоэффективно, по сравнению с предыдущими сроками исследований: в эрит-роцитной массе регистрировалось увеличение морфологически трансформированных эритроцитов до эхино - и сфероцитов. Известно, что эхиноцитарным агентом является, в частности, перекись водорода. Кроме того, формирование эхиноцитов и сфероэ-хиноцитов связано с появлением гемина при окислительных процессах, приводящих к разобщению спектрина - белка п.4.1 - белка п.З. Трансформация в сфероцит, который рассматривается как предгемолитическая форма эритроцита, возможна при увеличении содержания лизофосфатидилхолина. Таким образом, морфологические изменения эритроцитов при хранении и при действии озона, по всей видимости, определяются изменением соотношения про- и антиоксидантных процессов в эритроцитах. Данное положение подтверждает и проведенное нами исследование. Так, в ходе изучения окислительных процессов в эритроцитах выявлено, что с увеличением сроков хранения эритроцитной массы наблюдалась интенсификация процессов ПОЛ. Концентрация МДА в эритроцитах возрастала более чем в 2 раза к 21-м суткам хранения, тогда как активность каталазы, напротив, снижалась на данном этапе контрольного времени. Использование озона изменяло баланс про- и антиоксидантных процессов, что проявлялось в снижении концентрации МДА и увеличении активности каталазы в течение 21-х суток хранения эритроцитной массы относительно контрольной серии. К 30-м суткам состояние про-и антиоксидантных систем при действии озона приближалось к значениям контроля. Полученные результаты свидетельствуют, что по мере увеличения срока хранения эритроцитной массы в эритроцитах усиливаются процессы липо-перокисдации, сопряженные с появлением эхиноцитов и сфероцитов. Морфологические изменения эритроцитов могут быть обусловлены модификацией, как липидной, так и белковой части эритроцитарных мембран, например, за счет деструкции участков бислоя, обогащенных двойными связями при активации перекисного окисления липидов, либо сшивками белков, образующихся посредством МДА. В результате изменения характера липид-белковых взаимодействий в мембране эритроцита происходит нарушение специфических мембрано-ассоциированных процессов, в том числе и транспорта ионов. Накопление в клетках ионов Са2+ приводит к активации мембраносвязанных фосфолипаз, что повышает транслокацию фосфатидилсерина на внешнюю поверхность мембраны и образование эхиноцитов. Изменение формы клеток и оксидативное повреждение мембран эритроцитов негативно влияет на вязко-эластичные свойства мембран и увеличивает агрегируем ость эритроцитов, что является отрицательным фактором при трансфузии эритроцитной массы. Обработка эритроцитной массы озоном определяет оптимизацию про- и антиоксидантных систем эритроцитов, что, вероятно, можно объяснить прямым действием озона на клетки. В ответ на введение озона в эритроцитах осуществляется образование в липидном бислое мембран клеток озонидов. Озонолиз клеточной мембраны эритроцитов ведет через расщепление цепей ненасыщенных жирных кислот к образованию гидроксигидропероксидов. Последние способствуют запуску различных звеньев системы антиоксидантной защиты. Активация антиоксидантных систем восстанавливает процессы перекисного окисления. Следует отметить, что сдвиг окислительно-восстановительного действия озона, приводит к накоплению окисленного глутатиона, следовательно, активации глюкозо-фосфатного шунга, и изменению метаболического состояния клеток. В наших экспериментах выявлено, что озонирование эритроцитной массы вызывало увеличение концентрации АТФ и 2,ЗДФГ при сроках ее хранения до 21 суток, тогда как обработка озонированным физиологическим раствором эритроцитной массы сроком хранения 30 суток не сопровождалась статистически значимым изменением концентрации АТФ и 2,ЗДФГ в эритроцитах. Наблюдаемые эффекты действия озона на содержание в эритроцитах вышеуказанных фосфатов, вероятно, можно объяснить модифицирующим действием озонидов на метаболизм эритроцитов. Под действием озонидов активируются ферменты гликолиза и пентозо-фосфатного шунта, снижается внутриклеточный ацидоз. В свою очередь, реализация такой активизации может быть обусловлена и снижением уровня молекулярных продуктов ПОЛ и усилением антиоксидантной системы защиты. Таким образом, озонирование эритроцитной массы способствует восстановлению формы эритроцитов за счет оптимизации процессов липопе-роксидации эритроцитарных мембран и повышения синтеза АТФ. Под действием озонидов, образовавшихся в процессе озонолиза двойных связей С=С полиненасыщенных жирных кислот в эритроцитах активируется мутазный шунт гликолиза, на входе которого образуется 2,ЗДФГ, который определяет прочность связи гемоглобина с кислородом, облегчает отдачу кислорода оксиге-моглобином и, таким образом, улучшает кислородное обеспечение тканей. Образовавшаяся АТФ используется в энергозависимых процессах эритроцитов, в том числе, сократительными белками, что улучшает деформабильность красных клеток. Восстановление указанных процессов при озонировании эритроцитной массы наблюдается при сроках ее хранения 7-21-е сутки. При этом озонирование эритроцитной массы сроком хранения 30 суток не вызывает улучшения исследуемых мор-фометаболических характеристик эритроцитов. Полученные результаты свидетельствуют, что разработанная технология обработки эритроцитной массы сроком хранения от 7 до 21 суток озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 2 мг/л улучшает морфометаболический статус содержащихся в ней эритроцитов и может быть использована для коррекции кислороднотранспортной функции крови у больных в критических состояниях. При возрастании сроков хранения эритроцитной массы наблюдается увеличение количества эхиноцитов, сфероцитов, концентрации МДА и снижение активности каталазы, что сочетается с уменьшением содержания органических фосфатов в эритроцитах. Обработка эритроцитной массы 7-, 14-, 21-х суток хранения озонированным физиологическим раствором с концентрацией озона 2 мг/л оптимизирует в эритроцитах нарушенное состояние про-, антиоксидантных систем, увеличивает концентрацию 2.3ДФГ и АТФ и, вследствие этого, способствует восстановлению формы эритроцитов (из сфероцитов и эхиноцитов до дискоцитов), что повышает их биологическую значимость. На 30-е сутки хранения эритромассы данные процессы при действии озона не проявляются, что свидетельствует о декомпенсации внутриэритро-цитарных морфометаболических процессов.

Авторы:

Издание: Общая реаниматология
Год издания: 2018
Объем: 10с.
Дополнительная информация: 2018.-N 1.-С.40-49. Библ. 33 назв.
Просмотров: 204