РОЛЬ КЛЕТОЧНОГО КОМПОНЕНТА СТРОМЫ В КОМПЕНСАТОРНЫХ ПРОЦЕССАХ ПРИ ДИФФУЗНОМ ПОВРЕЖДЕНИИ ПЕЧЕНИ

Аннотация:

Цель исследования - оценить роль клеточного компонента стромы в регенерации печени при ее токсическом повреждении. На экспериментальной модели токсического гепатита, вызванного внутрибрюшинным введением тетрахлорметана (СС14) показано, что на 3 сутки регенераторные процессы в печени проявляются в увеличении двуядерных гепатоцитов, Ki-67+ клеток и гепатоцитов делящихся митозом. Реакция стромального компонента выражается в увеличении количества CD45+, тучных и синусоидальных клеток (СК). На 7 сутки развития токсического гепатита нарастает альтерация гепатоцитов, что сопровождается резким снижением митотического индекса и количества Ki-67+ клеток. В стромальном компоненте отмечается снижение числа синусоидальных клеток, CD45+ и значительное увеличение тучных клеток с высоким содержанием секреторных гранул. Ключевые слова: тетрахлорметан, токсический гепатит, печень, тучные клетки, синусоидальные клетки. Введение. В регенерации нормальной и патологически измененной печени принимают участие все ее клеточные элементы: гепатоциты, синусоидальные клетки, лейкоциты, клетки соединительной ткани (фибробласты, тучные клетки), а также внеклеточный матрикс, постоянно взаимодействующие между собой и составляющие единую структурно - функциональную систему. Исследование клеточного компонента стромы печени и ее основных элементов представляется актуальным, поскольку именно эти клетки участвуют в регуляции и координации как деструктивных, так и пролиферативных процессов в печени при ее диффузном повреждении, вызванном, в том числе, и различными токсикантами. В настоящее время пристальное внимание уделяется исследованию реакции синусоидальных и тучных клеток при токсическом повреждении печени, поскольку они обладают, как способностью усиливать альтерацию, так и стимулировать регенераторные процессы. СК представлены 4 основными разновидностями клеток, имеющих мезенхимальное происхождение: лейкоциты, эндотелиоциты, клетки Ито, клетки Купфера или фиксированные макрофаги, которые составляют основную часть от всей популяции синусоидальных клеток. Относящиеся к синусоидальным клеткам макрофаги печени осуществляют фагоцитоз, презентацию антигена, выделяя провоспалительные цитокины и привлекая нейтрофилы, базофилы и цитотоксические Т-лимфоциты. Кроме того, роль макрофагов заключается в регуляции завершения воспалительного процесса посредством выделения антивоспалительных факторов и факторов роста, стимулирующих пролиферацию гепатоцитов и ангиогенез. Известно также, что тучные клетки не только принимают участие в развитии отека в начальную фазу воспаления, но в регуляции продуктивно-пролиферативной фазы воспаления, выделяя факторы роста капилляров, цитокины, хемоаттрактанты. Неадекватное количество и (или) функциональная активность СК и мастоцитов могут сопровождаться нарушением соотношения фаз воспалительного процесса и проявляться в виде увеличения некротизированных клеток, развития цирроза и как следствие, угнетением регенераторных процессов в печени. Комплексные исследования изменения соотношения СК и тучных клеток при токсическом повреждении печени могут быть полезны при поиске новых подходов к коррекции нарушения восстановительных процессов органа посредством воздействия на определенные типы регуляторных клеток и изменения выраженности той или иной фазы воспаления. В условиях диффузного поражения печени, вызванного токсическими или инфекционными агентами, когда пролиферативная активность клеток печени угнетена, поиск источников образования новых гепатоцитов и сохранение оставшихся, является одной из актуальных задач современной токсикологии. Материалы и методы исследования. Эксперимент по моделированию токсического гепатита был выполнен на 40 крысах-самцах линии Wistar массой 180+10 г в соответствии с принципами международных этических комитетов (Директива Совета ЕС 2010/63/EU) и одобрен этическим комитетом Института иммунологии и физиологии УрО РАН (протокол (No-D-riM-2015-28). Крысы содержались в одинаковых условиях по 5 крыс в клетке на обычном рационе вивария со свободным доступом к пище и воде и температурным режимом 20±2°С. Для создания модели токсического гепатита использовали СС14, который вводили животным экспериментальных групп однократно внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг веса. Интактную группу составляли здоровые животные. Крысам контрольной группы вводили аналогичную дозу 0,85% раствора хлорида натрия (1 группа). Животных опытных групп выводили из эксперимента на 3 и 7 сутки передозировкой диэтилового эфира (соответственно 2 и 3 группы). Образцы печени погружали в 10% нейтральный формалин на 24 часа при комнатной температуре. Подготовку образцов для гистологического исследования осуществляли с использованием автоматического процессора Leica EG 1160 с последующей заливкой в парафин. Со срезов толщиной 3-4 мкм удаляли парафин, для этого стекла помещались последовательно в ксилол, в 100% спирт и в растворы с постепенным снижением концентрации спирта до полностью водного раствора. Структурное исследование проводили на микроскопе Leica DM 2500. Программу Leica Application Suite (V4) использовали для анализа изображений и морфометрического исследования, которое включало подсчет количества синусоидальных клеток в единице площади в 10-ти полях зрения при увеличении микроскопа х400. Тучные клетки выявляли при окраске препаратов толуидиновым синим, подсчитывали их количество в единице площади в 20-ти полях зрения при увеличении х400. Для оценки функциональной активности тучных клеток измеряли интенсивность окрашивания толуидиновым синим сульфатированных гликозаминогликанов в составе секреторных гранул цитоплазмы с помощью программы Leica Application Suite (V4), показатель выражали в единицах оптической плотности. Морфометрические исследования печени включали: определение индекса альтерации (количество гепатоцитов, %), определение митотического индекса %о, определение количества двуядерных клеток, %о. Индекс альтерации клеток (ИАК) рассчитывали по формуле (1): ИАК=ИН/АИ, (1) где ИН - индекс некроза; АИ - апоптотический индекс. Расчет митотического индекса осуществляли по формуле (2): МI = MNx1000 (%),(2) где М - число клеток в митозе; N - число клеток в зоне деления. Для определения митотической активности на препарате в зоне деления подсчитывали общее число клеток в поле зрения и из них число клеток в фазах митоза. Анализ проводили в 10 полях зрения. ИГХ методом выявляли в печени лейкоциты, экспрессирующие CD45+, и пролиферирующие гепатоциты по маркеру Ki67+, с использованием моноклональных антител соответственно mouse anti - rat CD45 clone OX -1 и anti-human Ki-67 clone B56 (BD, USA), а также вторичных антител biotin goat anti-mouse (BD, USA), тест-системы NovolinkTM Polymer Detection System (Novocastra Lab., Ltd) и автостейнера Pascal DAKO. Маркер Ki-67+ позволяет определять не только пролиферацию, но и готовность клеток к делению. Для реакции с Ki-67 применяли высокотемпературную обработку срезов в цитратном буфере, рН 6,0. Для устранения неспецифического связывания антител использовали блокирующий раствор BlockAid (Thermo Fisher, USA). Первичные mouse-anti-rat антитела и вторичные поликлональные антитела biotin-goat-anti-mouse (BD, США) использовали в разведении 1:50. Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода, использовали позитивные и негативные контроли антигенов для исключения неспецифического окрашивания. Определяли количество клеток, экспрессирующих CD45+ и Ki-67 в единице площади среза печени при увеличении 1000 в 20 полях зрения каждого образца с последующим пересчетом на 1мм2 среза. Вычисления и статистическая обработка результатов исследований выполнены с помощью пакета программ Statistica 10.0 и непараметрического критерия Манна-Уитни для 2-х независимых выборок. При проверке статистических гипотез использовался уровень значимости 5% (Р<0.05). Данные представлены в виде средне-е±ошибка среднего. Результаты и обсуждение. В связи с тем, что в ходе гистологического и морфометрического анализа тканей печени различий между группой интактных и контрольных животных не было установлено, в дальнейшем представлены результаты только контрольной группы. При гистологическом исследовании печени на 3 сутки после введения СС14 были отмечены признаки, характерные для острого токсического гепатита (очаговые некрозы гепатоцитов (рис. 1. В) с перифокальной лимфо-лейкоцитарной инфильтрацией), также обнаружены выраженная диффузная вакуольная дистрофия гепатоцитов, анизоцитоз, анизонуклеоз. В соответствии с гистологической картиной на 3 сутки после введения токсиканта отмечается достоверное увеличение количества СК с 9,69±0,48 (контроль) до 13,0+0,28 (рис. 4), значительное увеличение количества лейкоцитов с 15,9±2,3 (контроль) до 277,8±12,5 (рис. 4, рис. 3) и рост числа тучных клеток с 51,2±4,9 (контроль) до 94,7±12,7 (рис. 4, рис. 2), а также увеличение количества секреторных гранул в каждой тучной клетке с 0,045±0,011 до 0,071+0,015 относительно контроля (рис. 4). В модели индуцированного СС14 повреждения печени рядом исследователей было обнаружено увеличение числа тучных клеток в портальных областях, которое постепенно возрастало по мере увеличения степени фиброза. Увеличение количества печеночных тучных клеток свидетельствует о их значительной роли при патологии печени. Рост числа СК на 3 сутки после токсического воздействия на фоне компенсаторной реакции, сопровождающейся увеличением количества двуядерных (с 15,4+1,4 до 51,8+0,3) и находящихся в процессе деления гепатоцитов, экспрессирующих Ki-67, (с 14,3+1,5 до 47,6±10,9) (рис. 4) вероятно, связано с процессами инактивации токсиканта и фагоцитозом некротизированных клеток. Имеются сведения о том, что СК способны принимать участие в синтезе и ремоделировании компонентов экстрацеллюлярного матрикса, регулирующего функции гепатоцитов. На 7 сутки в печени экспериментальных животных наряду с уменьшением признаков экссудативного воспаления наблюдали сохранение деструктивных процессов. Уменьшение признаков воспаления на 7 сутки, является следствием значительного сокращения, по сравнению с предыдущим сроком, инфильтрации ткани печени лейкоцитами (рис 3, рис. 4). При подсчете СК обнаружено достоверное снижение этого показателя на 7 сутки не только относительно контроля, но и предыдущего срока эксперимента (рис. 4). При повреждении паренхимы печени СК выступают в роли мишени токсического воздействия и их регуляторное влияние на процессы регенерации снижается. В то же время отмечено дальнейшее увеличение количества тучных клеток на 7 сутки по сравнению с показателем, измеренным на 3 сутки (с 94,7±12,7 до 219,7+21,3) (рис. 2, рис. 4). Оптическая плотность секреторных гранул в единичной тучной клетке на 7 сутки по сравнению с предыдущим сроком не изменилась. Увеличение числа тучных клеток свидетельствует о том, что они выполняют роль индукторов и регуляторов восстановительного процесса в печени после токсического воздействия. Несмотря на уменьшение выраженности экссудативного воспаления, выявленного при исследовании гистологических срезов на 7 сутки эксперимента, количество поврежденных гепатоцитов не только не снизилось, а увеличилось по сравнению с показателем, измеренным на 3 сутки эксперимента (с 333,27+27,6 до 421,5±0,5) (рис 4), при незначительном снижении уровня двуядерных гепатоцитов, снижении митотического индекса (с 43,77±0,3 до 28,6±0,2) (рис 4) и количества Ki67+ гепатоцитов (с 47,6±10,9 до 14,3±2,6) (рис 4). Заключение. На 3 сутки эксперимента в ответ на действие токсиканта отмечается стимуляция регенераторных процессов, сопровождающаяся увеличением клеточного компонента стромы: лейкоцитов, тучных и синусоидальных клеток. В ранние сроки эксперимента СК выступают в роли мишени токсического воздействия, осуществляют фагоцитоз поврежденных гепатоцитов и способствуют завершению воспалительного процесса. Данное предположение подтверждается уменьшением числа CD45+ клеток, обуславливающих лейкоцитарную инфильтрацию. Уменьшение уровня СК коррелирует со снижением митотического индекса и количеством Ki67+ гепатоцитов. На 7 сутки токсического воздействия основная роль в регенераторной стратегии отводится тучным клеткам, которые выделяют факторы роста капилляров, цитокины и хемоаттрактанты. Выявленные закономерности дают основание для разработки новых подходов в лечении токсического гепатита. Исследование проведено в рамках бюджетной программы «Изучение механизмов регенераторных процессов в органах и тканях с использованием экспериментальных моделей экстремальных факторов и токсического воздействия на организм», № Гос. регистрации - АААА -А18-118020590107-0.

Авторы:

Издание: Токсикологический вестник
Год издания: 2018
Объем: 6с.
Дополнительная информация: 2018.-N 3.-С.32-37. Библ. 16 назв.
Просмотров: 116