Влияние экстракта амниотической мембраны на эпителизацию и неоваскуляризацию в моделях повреждения роговицы

Аннотация:

Проведена оценка влияния экстракта амниотической мембраны на миграционную активность клеток роговичного эпителия человека в клеточной культуре, а также на процессы эпителизации роговицы и неоваскуляризации ее стромы в ходе ее заживления после тяжелых щелочных ожогов в эксперименте. Было установлено, что экстракт не вызывает увеличения риска перфорации роговицы в отдаленные сроки после ожога, несмотря на торможение миграции эпителиальных клеток in vitro, что также может быть обусловлено стимуляцией неоваскуляризации. Применение амниотической мембраны (AM) в виде трансплантата, фиксируемого на глазной поверхности хорошо известный подход к контролю эпителизации и неоваскуляризации при различных заболеваниях роговицы. AM стимулирует восстановление целостности эпителия, ингибирует ангиогенез и обладает противовоспалительными свойствами, что позволяет применять ее в лечении повреждений или ожогов роговицы. Преимуществом AM человека можно назвать низкую иммуногенность, так как она не содержит молекул А, В и DR главного комплекса гистосовместимости, и поэтому реакции отторжения здесь наблюдаются крайне редко. Однако применение AM связано с необходимостью хирургического вмешательства, потребностью в свежем или консервированном материале, что препятствует широкому применению данного метода. Терапевтические свойства AM объясняют как ее защитным действием, так и влиянием на строму и роговичный эпителий экспрессируемых амнионом нерастворимых и растворимых молекул, а также выполнением механических функций. Основные биологические эффекты AM опосредуется факторами роста и тканевыми ингибиторами протеиназ. Экстракция сигнальных молекул из AM предполагает возможность создания растворимой, обладающей лечебными свойствами амниона лекарственной формы, которую можно использовать в виде капель или инъекций. В связи с этим целью настоящего исследования была оценка влияния инстилляций жидкого экстракта амниотической мембраны (ЭАМ) на заживление раны монослоя эпителия роговицы, а также на процессы эпителизации и васкуляризации роговицы в модели тяжелого щелочного ожога. Материал и методы. Получение ЭАМ. Амнион получали через 4 часа после кесарева сечения, выделяя его из плодных оболочек в стерильных условиях и трижды отмывая раствором Хэнкса. Амниотическую мембрану массой 5 г измельчали до фрагментов размером 2-3 мм. Измельченную массу смешивали с кварцевым песком (размер частиц 0,1 мм) и гомогенизировали ручным способом. Далее эмульсию AM суспензировали в физрастворе (20 мл) и центрифугировали при 2000 об./мин в течение 10 мин. Надосадочную жидкость, не содержащую визуально различимых частиц, отделяли от осадка и фильтровали через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,22 мкм. Аликвоты отфильтрованного экстракта разливали в одноразовые флаконы-капельницы в стерильных условиях и хранили до использования при -20°С. Получение клеточной культуры. Клеточная культура эпителия роговицы человека была получена из донорского материала через 36 часов после гибели донора и забора роговицы для кератопластики. После отделения внешних тканей глазное яблоко дезинфицировали раствором повидон-йода в течение 20 с и трижды отмывали в растворе Хэнкса. Корнеосклеральное кольцо формировали разрезом длиной 3 мм кзади от лимба. После отделения цилиарного тела его погружали в раствор Хэнкса и разделяли на фрагменты размером 3x4 мм. Полученные фрагменты переносили в чашки Петри диаметром 3,5 см со средой DMEM:F12 и 10% сывороткой крови крупного рогатого скота, укладывая внешней поверхностью на дно чашки. Фрагменты инкубировали 72 часа при 37°С в 5% СОг. После миграции эпителиальных клеток с эксплантов на дно чашек фрагменты корнеосклерального кольца удаляли, а клетки трипсинизировали для пересева в культуральные флаконы 25 см2. Культуру выращивали до третьего пассажа, с последующим переносом в 48-луночные планшеты в условиях, описанных выше. Оценка токсичности выполнялась в стандартном МТТ-тесте. Для этого клеточная культура пересевалась в 96-луночные планшеты в концентрации 104 клеток/лунка со средой DMEM:F12 и 10% сывороткой крови крупного рогатого скота. Поле формирования монослоя (24 часа инкубации) производили замену среды на DMEM:F12 с 1% сывороткой. После инкубации в течение 24 часов в лунки вносили 20% ЭАМ до концентрации 6,3%> в контрольные лунки - 0,05% раствор хлоргексидина (положительный контроль) до концентрации 0,005% или стерильную среду (отрицательный контроль). После инкубации в течение 24 часов во все лунки добавляли аликвоты (20 мкл) раствора МТТ (1 мг/мл) и инкубировали четыре часа с периодическим микроскопическим контролем формирования кристаллов формазана. Через четыре часа среду удаляли и во все лунки вносили 100 мкл диметилсульфоксида (Биолот), в котором формазан хорошо растворим. После растворения кристаллов формазана планшеты сканировали, а интенсивность окрашивания раствора в лунках оценивали на полученном цифровом изображении с помощью программы Image J. Интенсивность окрашивания, выраженная в градациях серого (от 0 до 255 ед.), отражала жизнеспособность клеток в культуре. Тест заживления раны культуралъного монослоя стандарт для оценки миграционной способности клеток. После пересева культуры эпителия роговицы в планшеты и формирования монослоя культуральную среду заменяли на среду DMEM:F12 с 1% сывороткой. Через 24 часа инкубации в условиях пониженного содержания сыворотки в каждом образце культуры с помощью наконечника пипетки наносили рану монослоя. После этого среду удаляли, лунки промывали раствором Хэнкса и добавляли свежую среду DMEM:F12 с 1 % сывороткой. После этого во все неконтрольные лунки вносили ЭАМ до концентраций 6,3, 0,63 и 0,063%, а в контрольные лунки - эквивалентный объем раствора Хэнкса. Интенсивность заживления раны оценивали по расстоянию между ее краями через 24 и 48 часов. Для этого из лунок удаляли культуральную среду, и материал фиксировали 70% этанолом 10 мин. После удаления фиксирующего агента лунки окрашивали генцианвиолетом в течение 5 мин и трижды споласкивали дистиллированной водой. Моделирование щелочного ожога. Эту часть исследования выполнили на шести половозрелых кроликах (12 глаз) породы шиншилла весом 2,5-3 кг. Моделировались щелочные ожоги роговицы и лимба площадью 50% (сектор ожога 180°), которые наносили с помощью изготовленных из лабораторной фильтровальной бумаги аппликаторов, пропитанных 1,0N раствором NaOH. Время аппликации составляло 1 мин с последующим тщательным вымыванием остатков щелочи физраствором. После ожога проводились инсталляции 0,4% раствора гентамицина в оба глаза и ЭАМ в неконтрольный (левый) глаз 4 раза в сутки в течение 30 суток. Оценка эпителизации и неоваскуляризации роговицы в модели щелочного ожога. В ходе наблюдения регулярно оценивали площадь эпителизации и неоваскуляризации роговицы. Результаты регистрировали на 1, 3, 7, 21 и 30-е сутки после ожога при окрашивании глазной поверхности 1% флюоресцеином натрия. Для количественной оценки площади ожога, хода эпителизации в процентах использовали стандартный пакет программы обработки цифровых изображений Adobe Photoshop CS5 (Adobe Systems Inc., США) и проекционную сетку. Статистическую обработку полученных данных осуществляли путем вычисления средних арифметических и их ошибок с оценкой достоверности разности по критерию Стьюдента. Результаты исследования. Оценка токсичности. На основании МТТ-теста с колориметрией ЭАМ был признан нетоксичным. Показатель оптической плотности в образцах с концентрацией ЭАМ 6,3% составил 154,2+11,3 ЕД, а в положительных контрольных образцах с 0,005% хлоргексидином (в качестве агента, снижающего жизнеспособность всех видов клеток) - 125,2±14,1 ЕД. Показатель оптической плотности в отрицательных контрольных образцах равнялся 165,0+10,0 ЕД и не имел статистически значимых отличий при сравнении с образцами с ЭАМ. Тест заживления раны культуралъного монослоя. Через 24 часа после нанесения раны в образцах культуры с ЭАМ в концентрациях 6,3, 0,63 и 0,063% и в контроле ширина раны монослоя составила, соответственно 539,5±94,4,474,0±77,2,389,5±141,0 и 316,5±74,9 мкм. Статистически значимые различия по сравнению с контролем были выявлены для образцов с содержанием 6,3 и 0,63% экстракта. Через 48 часов в образцах культуры с содержанием ЭАМ в концентрациях 6,3,0,63 и 0,063% и в контроле ширина раны монослоя была 433,0± 130,3, 235,5±56,4, 159,5±100,0 и 132,5±53,2 мкм, соответственно. Статистически значимые различия по сравнению с контролем определены для всех образцов (рис. 1). Эпителизация и неоваскуляризация роговицы в модели щелочного ожога. Во всех группах сразу после ожога в секторе повреждения отмечали деэпителизацию, равномерное глубокое помутнение стромы роговицы по типу «матового стекла» и ишемию прилежащей лимбальной зоны. Через 24 часа отмечали начало эпителизации обожженной стромы со стороны прилежащих интактных участков роговицы. К 3-м суткам зона эпителизации в опытной группе составила 89,0±3,0%, в контрольной группе - 52,2+1,4%. На 7-е сутки деэпителизированный участок сохранялся в виде эрозии эпителия в центре. В пределах обожженной стромы вновь наросший эпителий имел признаки цитопатии в виде островкового прокрашивания флюоресцеином. В опытной и контрольной группе площадь эпителизированной зоны составила 12,3±2,3 и 78,1±1,9%. Возобновление эпителизации в опытной группе отмечали после 21-х суток, полную эпителизацию роговицы - на 30-е сутки с сохранением эпителиопатии (рис. 2). К 30-м суткам площадь эпителизации в контрольной и опытной группах составила 21,2±10,2 и 99,5±0,45%, соответственно. В контрольной группе на 3-й сутки после ожога наблюдали активное врастание сосудов в строму роговицы со стороны неповрежденного лимба. Площадь неоваскуляризации в контрольной и опытной группах составила 5,5± 1,2 и 7,5± 1,7%, соответственно. Статистически значимое увеличение площади неоваскуляризации при применении ЭАМ по сравнению с контролем было зафиксировано на 7-е сутки 28,5± 12,7 и 12,1 ±3,2%, соответственно, и сохранялось на протяжении всего периода наблюдения, составив к исходу 30-х суток 81,9±18,1 и 43,3±4,7%. Со стороны обожженного лимба сосуды начинали врастать в строму на 30-е сутки. Врастание сосудов сопровождалось постепенным помутнением стромы. Начиная с 30-х суток в 3 из 6 случаев в опытной группе и в 4 из 6 случаев в контроле наблюдали перфорации роговицы (рис. 3). Обсуждение полученных данных. Результаты данного исследования демонстрируют дозозависимое торможение миграции клеток роговичного эпителия под действием ЭАМ in vitro, без цитотоксических эффектов высоких концентраций экстракта, а также стимуляцию неоваскуляризации роговицы в модели тяжелого химического ожога роговицы и лимба in vivo. AM применяется в офтальмологии для лечения широкого спектра заболеваний переднего сегмента глаза: недостаточности стволовых лимбальных клеток, рубцующемся пемфигоиде, буллезной кератопатии, персистирующих эпителиальных дефектах и перфорациях роговицы, при лечении последствий ожогов глазной поверхности и в хирургии глаукомы. Лечебный эффект AM изучен не до конца, однако предполагается несколько механизмов: 1) AM выполняет функцию биологического бандажа, защищая регенерирующий эпителий от повреждения краями век (вторично, это может снижать выработку эпителием провоспалительных сигнальных молекул и подавлять воспаление); 2) AM выступает в роли базальной мембраны, облегчая адгезию и миграцию клеток эпителия, и ускоряя эпителизацию; 3) кубический эпителий, выстилающий амниотическую сторону AM, и ее строма содержат ряд цитокинов и факторов роста, влияющих на эпителизацию роговицы. Среди сигнальных молекул AM преобладают трансформирующий фактор роста-бета, эпидермальный фактор роста и основной фактор роста фибробластов, стимулирующие клеточную миграцию и пролиферацию; 4) за счет гиалуроновой кислоты, в большом количестве содержащейся в строме и инактивирующей сигнальный каскад трансформирующего фактора роста-бета, AM подавляет фиброз; 5) AM подавляет неоваскуляризацию за счет тромбоспондина-1 и тканевых ингибиторов матриксных металлопротеиназ типов 1-4. В отличие от собственно AM биологические эффекты ЭАМ обусловлены исключительно действием растворимых сигнальных молекул, входящих в AM. Поскольку в ЭАМ, использованном в этом исследовании, потенциально входит большое число сигнальных молекул AM, в том числе, с противоположными эффектами, его биологические эффекты в различных экспериментальных моделях могут иметь разнонаправленный характер. Это продемонстрировано в данном исследовании: ЭАМ тормозил клеточную миграцию in vitro, но не оказывал существенного влияния на эпителизацию in vivo, стимулируя неоваскуляризацию. Торможение миграции клеток эпителия в культуре могло быть обусловлено блокированием активности матриксных металлопротеиназ (являющихся модуляторами клеточной миграции) их тканевыми ингибиторами, а ангиогенез - факторами роста эндотелия сосудов и фибробластов. Поскольку концентрация фактора роста эндотелия сосудов в AM существенно меньше концентрации фактора роста фибробластов, потенцирование ангиогенеза ЭАМ может быть в большей степени обусловлено именно последним. Динамика эпителизации роговицы под действием ЭАМ в модели тяжелого химического ожога существенно отличалась от нормальной динамики эпителизации in vivo: 1) в ранние сроки наблюдалось ее замедление (что соответствовало торможению заживления раны культурального монослоя in vitro), 2) в поздние сроки отмечена более полная эпителизация по сравнению с контролем (что может быть объяснено более интенсивной неоваскуляризацией). В ходе данного исследования было установлено, что ЭАМ не вызывает увеличения риска перфорации роговицы в отдаленные сроки после ожога, несмотря на торможение миграции эпителиальных клеток in vitro, что также может быть обусловлено стимулированием неоваскуляризации. Таким образом, в условиях неэкспериментального патологического процесса применение ЭАМ может продемонстрировать положительные эффекты в отношении предотвращения развития перфораций без токсического воздействия. Ключевым отличием от результатов других исследований AM и ее экстрактов в нашей работе стала демонстрация стимулирования неоваскуляризации, что можно объяснить преобладанием эффекта фактора роста фибробластов над эффектом тканевых ингибиторов матриксных протеиназ in vivo, возможно, из-за различий их экстрактивности в использованной методике. Полученные результаты указывают на перспективность дальнейшего изучения эффектов ЭАМ для лечения тяжелых ожогов или язв роговицы.

Авторы:

Издание: Тихоокеанский медицинский журнал
Год издания: 2018
Объем: 4с.
Дополнительная информация: 2018.-N 2.-С.46-49. Библ. 15 назв.
Просмотров: 57